這里介紹的方法，是用一個生物素化的引物來幫助純化第一鏈產物。這些純化技術是可以互換的。與之類似，使用這里所介紹的基于寡核苷酸-(dT) 的引物，在反轉錄的起始階段使用的基因特異性引物（如上所述）也是可以互換的。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。
| 試劑、試劑盒 | 寡核苷酸引物cDNA 文庫HerculesHot-Start 聚合酶HerculesHot-Start 聚合酶緩沖液dNTP 溶液TE反轉錄緩沖液RNasinSuperscript II 逆轉錄酶生物素標記的引物 Ptotal帽子發現接頭引物poly(A)+RNA |
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| 儀器、耗材 | 熱循環儀鏈霉抗生物素蛋白磁性珠磁性分離器水浴或加熱儀 |
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| 實驗步驟 | 試劑
5'RACE 能否成功依賴于帽子發現接頭序列結合在 cDNA 合成的起始處。這一步依賴于在第一鏈 cDNA 末端附加額外的寡核苷酸（dC)。已有證據顯示，反轉錄緩沖液如果存在Mn2+，能大大提高這一步的效率（SchmidtandMueller1999)。
第 1 階段：反轉錄產生 cDNA 模板
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
dNTP 溶液（含 4 種 dNTP, 各 10mmol/L)
TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5，1mmol/LEDTA、pH8.0)，預熱至 50°C
2. 酶和酶緩沖液
反轉錄緩沖液，5X(250 mmol/LTris-HCl、45°C 時 pH8.3,30 mmol/LMgCl2，10 mmol/LMnCl2，50 mmol/LDTT，1mg/mlBSA)
RNasin
Superscript II 逆轉錄酶（Invitrogen)
3. 核酸和寡核苷酸
生物素標記的引物 Ptotal(生物素標記的引物可以從 Invitrogen 訂購）。Ptotal 引物的序列見圖 25-6。
帽子發現接頭引物（1mmol/L)。該引物的序列見圖 25-6。
poly(A)+RNA
4. 特殊設備
鏈霉抗生物素蛋白磁性珠（例如 Promega 的 Streptavidin MagneSphere particles)
磁性分離器（例如 Promega 的 MagneSphere Magnetic Separation Stand)
預設為 42°C、45°C、50°C、70°C、80°C 的水浴或加熱儀
二、方法
1.在一個無菌的離心管中，于冰浴上混合以下轉錄組分。
反轉錄緩沖液，5X 4ul
dNTP 溶液（10 mmol/L) 0.4ul
帽子發現接頭引物（1mml/L) 1ul
RNasin(40U/ul) 0.25ul
2.在另一個管中，在 12ul 水中加入 lug 的 poly(A)+RNA 和 10pmol 的 Ptotal 引物，80°C 溫育 3 min, 迅速在冰上冷卻，在離心機中離心 5s，加入第一步的反轉錄組分。
3.加 1ul(200U) 的 Superscript II 逆轉錄酶，室溫溫育 5 min，42°C 溫育 30 min，45°C溫育 30 min，然后 50°C 保溫 10 min。
4.70°C 溫育 15 min，使逆轉錄酶失活，用鏈霉抗生物素蛋白磁性珠分離第一鏈 cDNA,要按照生產商的說明進行操作，鏈霉抗生物素蛋白磁性珠的用量是所用生物素化的引物的量的 5 倍。用 TE 在 50°C 洗 3 遍，去掉過量的帽子發現接頭（按照生產商的說明）。
5.用 TE 將反應混合物稀釋至 0.5 ml,4°C 保存（這就是 cDNA 文庫）。
第 2 階段：cDNA 的擴增
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
dNTP 溶液（含 4 種 dNTP，各 10 mmol/L)
2. 酶和酶緩沖液
HerculesHot-Start 聚合酶（Stratagene)
HerculesHot-Start 聚合酶緩沖液（10X)
也可以用其他的熱啟動 PCR 系統，例如 Roche 的 Expand High Fidelity 系統。
3. 核酸和寡核苷酸
生物素化的 cDNA 文庫（由第 1 階段得到）
寡核苷酸引物 GSP1 和 Po(用于 3'RACE), 或 RGSP1 和 Uo(用于 5'RACE),Po 和Uo 的序列見圖 25-6
4. 特殊設備
可設程序的熱循環儀
5. 其他
如果需要進行第二輪擴增，在第 5 步和第 6 步需要下列試劑。
引物 GSP2 和 Pi(用于 3'RACE)，或 RGSP2 和 Ui(用于 5'RACE)。Pi 和 Ui 的序列見圖 25-6。
TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5，1mmol/LEDTA、pH8.0)
二、方法
1. 第一輪
(1) 在一個無菌的 0.2 ml 離心管中混合以下組分。
Hercules Hot-Start 聚合酶緩沖液（10X) 5ul
dNTP 溶液（10 mmol/L) 1.0ul
HerculesHot-Start 聚合酶 2.5U
H20 至 50ul
(2) 加入 1ul 的 cDNA 文庫（充分重懸磁性珠）和 25pmol 的 GSP1 與 Po 引物（用于 3'RACE)，或 25pmol 的 RGSP1 與 Uo 引物（用于 5'RACE)。
(3) 在熱循環儀上 98°C 加熱 5 min，使第一鏈產物和鏈霉抗生物素蛋白變性，并激活聚合酶。冷卻至合適的溫度退火 2 min,72°C 延伸 40 min。沒有必要在溫育過程中使鏈霉抗生物素蛋白磁性珠保持懸浮狀態，因為生物素不能與變性的鏈霉抗生物素蛋白相互作用。據報道苯乙烯珠更小，在不攪動的情況下能保持懸浮狀態，因此更有優勢（Schrammet al.2000)。
(4) 按下列程序進行 30 個擴增循環。
72°C 延伸時間一定要根據產物的大小和所用聚合酶的擴增速率進行調整。
2. 第二輪（如果需要）
(5) 取第一輪的部分擴增產物，用 TE 以 1:20 稀釋。
(6) 用第一輪的程序，但省略掉 2 min 的退火和 72°C 40 mm 的延伸步驟，用 GSP2 和 P1引物（用于 3'RACE), 或 RGSP2 he U1 引物（用于 5'RACE) 擴增 1ul 上述稀釋材料。 展開 |
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