平滑肌細胞培養方法4

 動脈平滑肌細胞培養的幾個問題

組織塊大小邊緣密度翻面時間觀察時間對原代細胞萌發的影響

對于貼塊法的原代培養來源，由于細胞并非直接獲得，而是從組織塊邊緣長出，其中有一“突破過程”，且細胞萌發后尚需一定的細胞密度才能使其存活、增殖，故組織塊大小、邊緣、密度均影響細胞萌出與否及細胞存活、增殖。公認的方法是將血管剪成1 mm²大小組織塊[1~3]。張映娜等認為組織塊0.5~2 mm²范圍內，大小影響不大（可調整翻瓶時間以保證組織塊貼壁）[4]。但如組織塊超過2 mm²將增加細胞萌出的阻力。而組織塊邊緣整齊、光滑、密度

亦對細胞生長起著重要作用。組織塊邊緣過度受損或毛糙不平及組織塊密度過稀或重疊將使細胞很難萌出。作者認為剝除內膜、外膜時用力適中，避免機械拉傷，將鑷子夾過處切去，剪切時力求一次剪斷。切組織塊時不要離開培養液操作，保持邊緣濕潤，組織塊密度以中瓶（100 ml）鋪放取自6~8只150~250 g大鼠胸主動脈剪碎組織為宜，而小瓶（70 ml）則以3~4只為佳，且相同重量的大鼠，以月齡較小者為優。翻面時間一般認為3~6 h，具體時間應根據上述影響因素摸索而定。一般5~7 d后觀察可見細胞從組織塊邊緣呈放射狀長出，但5 d內不宜移動，以免貼壁的組織塊脫落，脫落的組織塊很難有細胞的萌出。

適宜的消化

一般認為細胞傳代消化以細胞成片收縮，變圓變亮，細胞間隙增大時為宜。它主要取決于胰蛋白酶的濃度，pH值、溫度、作用時間，而各實驗室報道不一[5~7]。過高濃度的胰蛋白酶達到適宜標準的時間短，僅數十秒，不易控制，易使消化過度，濃度過低達到適宜標準的時間過長，易嚴重損傷細胞膜，細胞難以貼壁。通過實踐摸索，作者認為加入0.05%胰蛋白酶和0.02%的EDTA混合液在溫箱內孵育2~3 min即可達到合適的消化度，0.03%的胰酶和0.02%的EDTA混合液亦可達到同樣效果，需及時取出觀察，終止消化。實驗中還應根據傳代后死細胞多少而做適當調整。作者通過對大鼠主動脈平滑肌細胞培養的長期摸索與實踐，優化培養方法，使組織貼塊法更經濟實用，為研究提供大量遺傳性質均一、功能狀態良好的細胞。

第一次傳代時機

一般的培養方法是選取細胞達亞融合狀態時進行傳代[1~3]。但貼塊法原代培養時細胞生長往往不均勻，經常是一些區域已長成致密細胞層，一些區域仍未見細胞生長，這種情況下，當整瓶細胞達亞融合時，致密細胞層已老化。作者通過摸索，認為當原代培養5~7 d后可移出孵箱觀察，如培養液變黃可部分換藥繼續培養，每隔2 d觀察一次。瓶中若有部分區域達到亞融合狀態即可傳代，或到10 d左右仍未達到亞融合狀態，但達到50%左右融合亦可進行傳代，為保證傳代細胞密度可將細胞傳至小體積培養與封閉培養相結合。

07 中醫兒科雜志

1.2 細胞培養方法

1.2.1原代培養

Wistar大鼠20只，斷頸處死后，浸泡在75%酒精中5 min，移入超凈工作臺，在無菌盒蓋上迅速取

出心肺組織與胸主動脈，在含青霉素100 U/mL、鏈霉素100μg/mL的無菌PBS液的培養皿中，沖洗2次，迅速分離出主動脈和肺動脈，并仔細剝除纖維層和外膜。更換培養皿，用眼科剪沿縱行剖開，內膜面向上，用眼科彎剪自上而下輕刮2～3遍，以去除內皮細胞。然后再換培養皿，加1滴DMEM，反復剪切成1 mm³小塊（剪切10 min左右）。每只大鼠血管組織塊可接種3個25 mL培養瓶，瓶內加入3 mL含20%新生牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100μg/mL的DMEM培養液，翻轉濕潤瓶底，然后瓶底向上，用尖吸管從培養皿粘吸出小組織塊，擺放在培養瓶底，小塊相互間距離以0.5 cm為宜。輕翻轉培養瓶，令瓶底向上，置于37℃、5%CO₂培養箱3～5 h，使小塊微干涸；然后輕輕翻轉培養瓶，令瓶底向下，讓培養液慢慢覆蓋于瓶底上的組織小塊，置培養箱中靜置培養，3 d換1次培養液[1]。

1.2.2傳代培養

待原代培養的細胞從組織塊長出，數量增加至細胞長滿瓶壁或占瓶壁60%～80%時，即可進

行傳代培養。吸棄原培養液，向培養瓶中加入PBS液洗凈殘留培養液，加0.125%胰蛋白酶2 mL，在室溫中將培養瓶放于倒置顯微鏡下觀察。待細胞回縮變鈍變圓、細胞間隙增大后，立即直立或翻轉培養瓶，吸除消化液，用含10%新生牛血清的培養液終止消化，用尖吸管反復吹打瓶壁細胞，使之脫落瓶壁并形成細胞懸液，再分裝接種入培養瓶，根據細胞密度按1：2或1：3分裝，3 d換液1次，4～6 d再傳代。

07中國心血管病研究雜志 大鼠胸主動脈平滑肌細胞的培養與鑒定

1材料與方法

1.1材料SD大鼠體重90～120 g，雌雄不限，購于華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心。DMEM高糖培養基、新生牛血清購于美國GIBCO公司，胰蛋白酶購于美國Sigma公司，平滑肌肌動蛋白、SP-9000免疫組化染色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司，其余試劑均為國產分析純。

1.2方法

1.2.1原代培養頸椎脫臼處死大鼠，75%乙醇浸泡5 min，超凈工作臺內開胸取胸主動脈，置于含有預冷PBS的培養皿中去除血污，獲取干凈光滑的血管段，去除外膜與內膜。在另一含少量培養液培養皿中，將中膜剪成1 mm²大小的組織塊。用吸管將組織塊貼于培養瓶底面，組織塊間距2～3 mm。加20%新生牛血清的培養液2～3 ml，將培養瓶直立于37℃、5%CO₂培養箱中，待4～6 h后組織塊與培養瓶黏附后，平置培養瓶，4～5 d后首次換液。

1.2.2換液方法

細胞換液主要根據細胞生長狀況及培養液的顏色變化決定。當細胞增殖旺盛，培養液由桃紅色變成黃色時，需換液。棄去舊培養液加PBS液2 ml清洗后吸棄，再加入適量新鮮培養液，也可進行半量或2/3量換液。

1.2.3傳代方法

棄去舊培養液后，PBS液清洗2次。向瓶內加入適量的0.25%胰蛋白酶液，在倒置顯微鏡下觀察，當胞質回縮、細胞間隙增大時，加含血清的培養液迅速終止消化。棄去瓶內液體，加入含10%新生牛血清的DMEM培養液反復吹打瓶壁細胞，計數后分別接種到新的培養瓶內。