簡介
藥物有效性和安全性篩選成本的持續增加導致了對創新技術的需求，從而在藥物發現過程中更早地進行表征和特性的檢測分析。FDA正在制定化合物檢測的指導方針，以確保藥物的安全性，使得藥物無需因為不良反應而撤市， 例如阻斷心臟hERG通道，并導致像尖端扭轉型室性心律失常這樣的癥狀。這一方向被稱為全面的體外心律失常試驗或CiPA項目。誘導多能干細胞(iPSC)分化的心肌細胞因其用于評估對心臟功能和安全性的復合作用，在體外模型系統被廣泛使用。鈣信號振蕩的結果可以反映細胞內鈣離子濃度的變化， 從而可以使用鈣敏感染料如EarlyTox?熒光染料試劑盒進行信號的檢測。ScreenWorks?Pro軟件可以分析心肌細胞跳動峰值的頻率，峰值10%的振幅峰寬，以及其他參數以高通量篩選的方式來描述化合物影響心肌細胞。
干細胞公司CDI (Cellular DynamicsInternational) 已經開發了一種增強版的iPSCs分化的心肌細胞，其復蘇后恢復的速度比之前版本的iPSCs更快。這樣的改進使得在FLIPR Tetra 高通量實時熒光檢測分析系統上檢測化合物對跳動的心肌細胞鈣瞬變信號影響的工作流程縮短生長時間5 - 7天。圖1是示例的工作流程。本文中我們闡述了一些癌癥化合物的檢測，其中一些已知會影響hERG通道，其它化合物已知可以阻斷hERG通道。
優勢
? 縮短細胞培養時間，提高實驗的工作流程和質量
? 在藥物發現過程中更早地發現可能導致安全問題的化合物
? ScreenWorks Peak Pro軟件簡化數據分析
材料
? iCell? Cardiomyocytes2 試劑盒，包括細胞、鋪板培養基和維持培養基 (Provided byCellular Dynamics, International)
? 0.1% (w/v) 明膠
? 384孔黑壁底透多孔板 (Corning PN 3712)
? EarlyTox 心肌細胞毒性檢測試劑盒(Molecular Devices PN R8210)
? 測試化合物和DMSO (Sigma Aldrich)
? FLIPR Tetra 高通量實時熒光檢測分析系統(Molecular Devices)
準備iCell心肌細胞多孔板
在iCell心肌細胞使用指南的指導下，用0.1%的明膠包被384孔黑壁底透多孔板。iCell心肌細胞復蘇后以8000個細胞每孔的密度鋪在每孔25μL的培養基中。細胞在37°C、5% CO2、以及100%濕度條件下培養24小時。細胞形成單層并更換成維持培養基。細胞每隔一天更換一次維持培養基。在第5天，細胞開始同步跳動并可以用于實驗。
準備化合物板用于篩選檢測
為便于篩選檢測，化合物溶于100% DMSO配置成10 MM的母液。維持培養基稀釋母液至10-100 μM的檢測濃度。在使用FLIPRTetra系統檢測前，提前24小時將稀釋好的化合物溶液添加到每個孔中。DMSO在培養基中的最終濃度為0.15%(v / v)。濃度范圍從30或100μM對數稀釋的每個濃度的化合物進行兩次(n = 2)或三次(n = 3)的檢測。
使用FLIPR Tetra系統觀察鈣振蕩
實驗前24小時，以終濃度30μM開始的對數稀釋的各種化合物加入到iPSC 心肌細胞中。檢測之前兩個小時25μL體積的溶于維持培養基的2倍濃度的EarlyTox心肌細胞毒性檢測染料添加到每孔中，并在37°C、5% CO2條件下孵育。當細胞從培養箱取出后，鈣離子濃度的變化會隨著細胞的振蕩而變化，從而引起FLIPR Tetra系統所記錄的熒光信號的改變。在ScreenWorks工作軟件中的實驗方案和參數設置如表1所示。數據分析使用了ScreenWorks PeakPro軟件模塊，并在GraphPad Prism 6中繪制了圖形。
