前言
報告基因對于基因表達的研究來說是非常有用的工具，它可以代替要研究的目的基因，從而幫助我們了解目的基因的信號通路和相關的疾病。熒光素酶是最常用的報告基因，使用光度計和化學發光功能的微孔板讀板機我們可以很容易的檢測到熒光素酶，另一方面，由于在細胞實驗中其背景較低，因此具有很高的靈敏度。我們通常用螢火蟲熒光素酶表達水平高低反映出我們感興趣的基因在系統中的地位。而海腎來源的熒光素酶則更常在多熒光實驗中作為第二種報告基因，來規范化多種在不同樣本中變化較大的指標如轉染效率，細胞活力等。
SpectraMax? DuoLuc? Reporter
試劑盒可以對哺乳動物細胞中的螢火蟲和海腎熒光素酶進行高靈敏度的定量。依次向微板孔中加入兩種適量的反應試劑即可檢測熒光。這種雙熒光信號檢測系統可以在歸一化檢測熒光信號(螢火蟲熒光)的同時提供持續表達的對照熒光信號(海腎熒光)。運用SpectraMax?
iD5 多功能微孔板讀板機、注射器系統和 SmartInject? 技術可以將實驗條件最優化。
在這里我們將展示如何在哺乳動物細胞模型中， 通過雙熒光報告檢測系統和SpectraMax iD5微孔板讀板機來檢測核轉錄因子κB
(NF- κB)的活性。NF- κB是參與細胞進程中許多基因表達的“主要調節者”，如炎癥，免疫，分化，增殖和凋亡。腫瘤壞死因子α (TNF-
α)可以激活細胞信號通路來降解NF- κB的抑制劑，從而促使其釋放并進入核內，調節數百目的基因的表達。NF-
κB通路的紊亂可以誘發多種疾病，如多發性硬化病，糖尿病，阿爾茲海默病等，因此利用合適的工具加深我們對NF- κB通路的理解是十分必要的。
優勢
? 靈敏的雙報告系統檢測多熒光素酶
? 用對照質粒轉染進行均一化，提高結果的準確度
? SoftMax Pro軟件的預置模板可簡化操作
圖1 NF-κB信號通路。TNF-α激活信號層級反應使NF-κB抑制劑IKB降解，并釋放NF-κB轉錄因子。
材料
? SpectraMax 雙報告試劑盒(Molecular Devices cat. #R8361)
? HEK 293 細胞系 (ATCC cat. #CRL-1573)
? 培養基: DMEM + 10% fetal bovine serum +penicillin/streptomycin
? pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro] 螢火蟲熒光素酶質粒 (Promega cat. #E849A)
? pGL4.75[hRluc/CMV] 海腎熒光素酶質粒(Promega cat. #E693A)
? FuGENE HD 轉染試劑盒(Promega cat. #E2311)
? Opti-MEM 低血清培養基(ThermoFisher Scientific cat. #31985062)
? 96孔白板 (Corning cat. #3610)
? TNF-α 10 μg/mL PBS + 1 mg/mL BSA溶液(Sigma cat. #T0157)
? BrightMax 密封薄膜(Excel Scientific cat. #WT-50)
? SpectraMax iD5 多功能微孔板讀板機
? 具有 SmartInject技術的注射器系統
