實驗方法原理 反轉錄 PCR ( reversetranscriptase'PCR，RT-PCR ) 是一種從 RNA 擴增 cDNA 拷貝的方法。RT-PCR 對于獲得與克隆 mRNA 的5'、3' 末端序列和從非常少量的 mRNA 樣品構建大容量的 cDNA 文庫方面都是極為靈敏與通用的方法。
實驗材料 反轉錄酶DNA 聚合酶外源參考 RNA
試劑、試劑盒 擴增緩沖液氯仿dNTP 的貯存液乙醇酚氯仿胎盤 RNase 抑制劑
儀器、耗材 瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠屏蔽型槍頭離心管或微量滴定板正向排液式移液器PCR 儀水浴箱
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液與溶液
10X 擴增緩沖液
氯仿
4 種 dNTP 的貯存液（20 mmol/L，pH 8.0)
乙醇
MgCl2 ( 50 mmol/L)
酚：氯仿（1:1，V/V)
胎盤 RNase 抑制劑（20 單位/μl )
2. 酶與緩沖液
反轉錄酶（RNA 依賴的 DNA 聚合酶）
熱穩定的 DNA 依賴的 DNA 聚合酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠
4. 核苷酸與寡核苷酸
外源參考 RNA
用于 cDNA 合成的寡核苷酸引物
oligo ( dT）12~18 溶于 TE ( 100 μg/ml，pH 8.0)
隨機六核苷酸溶于 TE ( 1 mg/ml，pH 8.0）
基因特異性寡核苷酸（20 μmol ) 溶于水（終濃度 20 pmol/μl)
正義與反義寡核苷酸引物用于 cDNA 的 PCR 擴增
總 RNA ( 100 μg/ml ) 或帶 poly (A) + RNA ( 10 μg/ml ) 溶于水中
1. 一只盛有 10~100 個細胞的離心管，在 4℃ 下離心 5s，沉淀樣品。
2. 吸棄上清液，加 10~20 μl 冰冷裂解液。非常輕微地振蕩離心管，使細胞分散于裂解液中。
3. 離心管在冰浴上放置 5 min, 然后在 4℃ 高速離心 2 min，上清液可直接用于 RT-PCR 的模板。
5. 特殊設備
自動微量移液器的屏蔽型槍頭
離心管（0.5 ml, 薄壁擴增反應專用離心管）或微量滴定板
正向排液式移液器
PCR 儀
水浴箱水溫設置在 75℃ 和 95℃
二、方法
1. 轉移 1 pg~100 ng 的 poly(A) + RNA 或 10 pg~1 μg 的總 RNA 到一只新的離心管。
用水調整體積至 10 μl；將 RNA 樣品在 75℃ 變性 5 min, 將離心管迅速插入冰中冷卻。
2. 對含有這種變性的 RNA 樣品的離心管內依次加入如下試劑：
10X 擴增緩沖液 2 μl
20 mmol/L 4 dNTP 混合液（pH 8.0） 1 μl
引物（最優先的，見下面） 1 μl
約 20 單位/μl 胎盤 RNase 抑制劑 1 μl
50 mmol/L MgCI2 1 μl
100~200 單位/μl 反轉錄酶 1 μl
H2O 補足至 20 μl
溫育在 37℃ 反應 60 min。MgCl2 為反轉錄酶作用所必需。
設置 3 支陰性對照管。在一支對照管中加入合成第一鏈 cDNA 反應所需要的所有試劑，但不加模板 RNA；第 2 支對照管加入除了反轉錄酶外的所有試劑；第 3 支對照管加入除了引物外的所有試劑。這些對照管進行所有后續的實驗步驟。設置這些對照管能保證 cDNA 產物不是由于污染或由 RNA 的自身引導所致。
3. 將反應管在 95℃ 加熱 5 min，使反轉錄酶失活和 RNA-cDNA 雜合物變性。
4. 調整反應混合液體積以便正義和反義引物濃度在 20 pmol/L。
5. 離心管內加入如下反應試劑：
1X 擴增緩沖液（或調整反應體積至 99 μl） 77 μl
1~2 單位熱穩定 DNA 聚合酶 1 μl
6. 如果 PCR 儀沒有配置加熱蓋，在反應混合液的上層應加一滴礦物油（約 50 μl）。如果應用熱啟動 PCR 程序，在反應混合液的上層加一層石蠟油。放置離心管或微量滴定板在 PCR 儀上。
7. 擴增反應有交性、復性和聚合（延伸反應）；相應的循環條件與溫度列表如下：
8. 抽取每種擴增樣品 5~10 μl，用瓊脂凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析擴增結果，用 DNA marker 來判斷擴增片段的大小。凝膠一般用 EB ( 溴化乙錠）或 SYBR 金顆粒染色來觀察擴增的量與片段大小。
9. 若用礦物油覆蓋在微量離心管內樣品液體的上層（步驟6)，反應結束后可用 150 μl 氯仿抽提去除。
10. 把擴增產物克隆到已經制備好的相應的載體上。克隆之前，從擴增的 DNA 產物中分離去除殘余的熱穩定 DNA 聚合酶和 dNTP。然后，DNA 片段可以連接到一種平末端載體或 T 載體，或者用限制性內切核酸酶進行酶切后，再連接到具有相應末端的載體上。