異硫氰酸胍／氯化銫超速離心法制備RNA實驗

細胞和組織

氯仿氯化銫溶液二硫蘇糖醇EDTA乙醇異硫氰酸胍裂解緩沖液異丙醇N-月桂酰肌氨酸氯化鋰液氮β-巰基乙醇苯酚

離心機和轉子研缽和杵超速離心管

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

氯仿

氯化銫溶液，5.7mol/L(5.7mol/L 氯化銫，25 mmol/L 醋酸鈉，pH6.0，1mmol/LEDTA,pH8.0)

用焦碳酸二乙酯（DEPC) 處理過的水

二硫蘇糖醇（DTT)，0.2 mmol/L

EDTA,1mmol/L，pH8.0

乙醇，70%(體積分數）

異硫氰酸胍裂解緩沖液 (4mol/L 異硫氰酸胍，25 mmol/L 醋酸鈉，pH6.0,1mmol/LEDTA,pH8.0)

異丙醇

N-月桂酰肌氨酸，20%（200 g/L)

氯化鋰（LiCl),8mol/L

液氮

β-巰基乙醇,10 ml/L

苯酚, 水飽和，pH4.0

2. 離心機和轉子

BeckmanTi50 轉子或相當的轉子

3. 特殊設備

研缽和杵，用 DEPC 處理過的水洗滌，預冷

超速離心管（異質同晶共聚材料），或相當的 Polygon, 或相當的高速勻漿器

4. 細胞和組織

細胞/組織，凍于液氮

二、方法

1. 使用研缽和杵在液氮下將樣品研磨成細粉。使用 Polygon 均化器或其他合適的器具在 7 ml 胍裂解緩沖液中均質化組織或細胞（達 1X10⁹ 個）。

2. 將 4 ml5.7mol/L 的 CsCl 溶液加到超速離心管中。

3. 將 1ml5.7mol/L 的 CsCl 溶液、120ul10mol/L 的沒-巰基乙醇和 240ulN-月桂酰肌氨酸加到裂解產物中。

4. 將氯化銫/裂解產物混合物混合，小心使之位于離心管中的氯化銫溶液上分層。

5.20°C 下 180000 g 離心 21 h。

6. 移棄氯化銫上清液，小心避免擾動管底的 RNA 沉降物。

7. 小心將 RNA 沉降物再溶解于 750ul 異硫氰酸胍裂解緩沖液中。

8. 加等體積酚，混勻。

9.10000g 離心 15 min。

10. 將水相轉移到一新管中。重復水相的酚抽提，直到界面變清。

11. 向清澈的水相加 1 倍體積氯仿。

12. 混合，l0000 g 離心 l0 min。

13. 將水相轉移到一干凈試管中。加等體積的異丙酵和 1/10 體積 8mol/L 的氯化鋰。10000g 離心10min。

14. 移棄上清液。用 750ul70% 乙醇洗滌 RNA 沉降物，10000 g 離心。

15. 移棄乙酵，風干沉降物，再溶解于 50~500ul0.2 mmol/L 的 DTT 中。

16.RNA 儲存于-70°C。