| 實驗材料 | 中期染色體分裂相 抗地高辛抗體 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | 三磷酸核苷 Tth 或 Taq DNA 聚合酶 NaCl EDTA 20 X SSC Tween-20 乙醇 脫脂奶粉（粉末） 10 X dNTP 反應終止液 洗脫液 封閉液 |
| 儀器、耗材 | 蓋玻片 染色缸 恒溫裝置 |
| 實驗步驟 |
一、標準一步反應
PRINS 技術的操作規程有兩套，一套和 FISH 技術一樣，將樣本在熱甲酰胺中變性，然后按 3.4 立即在系列梯度冰冷乙醇中淬火。或按下面的敘述通過將標本和反應混合物共同加熱到變性溫度將樣本變性：
1.確定玻片有多大區域需要分析，選擇適合該區域的蓋玻片和一定數量的反應混合物。每毫米長度的蓋玻片用 1ul 的反應混合物。準備 6(VL 反應混合物完全覆蓋標準的玻片，并蓋上 24 mmX60 mm 的蓋玻片。對于較小的區域就要用較少量的反應混合物和較小的蓋玻片。
2.當反應混合物隨著蓋玻片展開的時候，將做好的標本放在有蓋子的電熱恒溫板上 94°C、4 min 變性（見注釋 4)。
3.將標本迅速轉移到 55~65°C 孵育 5~60 min，用于探針退火及鏈延伸。簡單重復序列的探針退火快，探針越復雜退火越慢，鏈的延伸實際上是瞬間完成的，因此退火時間決定孵育的時間。
4.將標本放到預熱到 55~65°C 反應終止液中 1 min，終止 PRINS 反應。
5.將標本轉移至 50 mL 的洗脫液中，室溫洗脫大約 3 min(實驗可以在這一步暫停，可以將標本在洗脫液中 4°C 放置過夜)。
6a.如果使用了熒光素標記核苷酸，現在就可以將標本復染、封片并在顯微鏡下計數分析。
6b.如果使用了地高辛標記核苷酸，需要按 3.6 將其用抗地高辛的抗體顯色。
二、ddPRINS
將 PRINS 過程中，在正確雜交探針進行 DNA 合成時所不需的核苷酸種類替換為相應的雙脫氧核苷酸即可（如當合成人端粒元件 CCCTAA 時用 ddGTP 替換 dGTP)。
三、組合標記
組合標記有兩個主要的不同策略，先進行 PRINS 反應或后進行 PRINS 反應。在 PRIN^FISH 中，PRINS 要先進行，這樣可以避免 FISH 探針參與 PRINS 反應，FISH 探針應在標本已用冰冷乙醇淬火后再加入。避免標本在 PRINS 檢測后再變性非常重要，因為標本變性會導致 PRINS 信號消失。而在 PRINS-免疫染色中，PRINS 應后進行。免疫染色后將標本在 2% 多聚甲醛中室溫固定 2 min，并在 PRINS 操作前用系列乙醇梯度（70%、90% 和 99%) 脫水以提高免疫染色的存在。
四、已變性樣本上的 PRINS
如果只能使用甲酰胺變性的標本，如恒溫裝置不足以提供加熱變性的溫度，標本在 70% 甲酰胺中 70°C 變性 2 min，或參考所在實驗室 FISH 技術變性的標準程序進行變性。如果前面已經進行了 PRINS 的操作，標本可能已經處于變性狀態。在這些情況下，將標本立即放入一 20°C 系列乙醇梯度中淬火以使目標 DNA 保持變性結構狀態非常重要。
1.變性后應盡可能快的將標本放入-20°C 系列梯度乙醇（70%、90% 和 99%) 中脫水各 3 min。
2.將標本從 99% 乙醇中移出，瀝盡液體。
3.在上述步驟操作過程中準備反應混合物。如果該反應是第二個 PRINS 反應，確保這次使用的是不同標記的 dNTP。
4.退火及鏈延伸：將樣本在 55?65°C 預熱 lmin。然后將同樣預熱的反應混合物加在標本上并隨著蓋玻片蔓延開。
5.和前面的操作一樣進行孵育、終止和洗脫。這時的標本就已經準備好，可以進行抗體染色及復染/封片。
6.如果需要進行第三次 PRINS 反應，重復步驟 1?5。
五、自身引物介導的原位標記（SPRINS)
SPRINS 可以按照上面步驟 2?5 進行操作（標本在任何一步不能進行變性操作，因此不需要第 1 步）。
六、直觀地高辛或生物素標記的 PRINS 產物
1.將含熒光素結合的抗地高辛抗體（或鏈霉親和素 2ng/VL) 的 50|uL 封閉液加到標本上。蓋上蓋玻片避光孵育 30~60 min。
2.用 50 mL 的洗脫液洗脫 2 次，每次 5 min。這時的標本已經可以進行復染和封片。
七、復染及封片
1.用含0.4umol/L DAPI 的抗淬滅劑溶液可以獲得藍色復染的 DNA。
2.用含 PI 的抗淬滅劑溶液可以獲得紅色復染的 DNA，用 20ul 含 0.5ug/ml 的抗淬滅劑溶液將標本封片。
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