張玉奎院士：蛋白質組定量新技術新方法研究

中國科學院大連化學物理研究所 張玉奎院士

        2014年4月26日，首屆全國質譜分析學術研討會在北京西郊賓館盛大開幕。來自中國科學院大連化學物理研究所的張玉奎院士為大家帶來題為《蛋白質組定量新技術新方法研究》的報告。

　　通過對特定生物樣本所有蛋白質在不同狀態下表達的動態變化進行規模化定量分析，對于發現重要生物功能的蛋白質、篩選疾病相關的生物標志物以及尋找藥物靶標等具有重大意義。張玉奎院士在報告中介紹了他在近年的研究中，發展蛋白質組定量的一些新技術新方法。

　　在樣品前處理方面，研究了低豐度蛋白質的選擇性富集問題，研制了多種針對糖蛋白和糖肽的選擇性富集材料，張玉奎院士列舉了 其中一例進行了詳細解說。以參與蛋白磷酸化過程的磷酸腺苷為配基，通過提高配基的親水性提高其對磷酸肽的選擇性，并使材料制備過程簡單易操作。以氨基磁球為基質，以三磷酸腺苷二鈉為配體，戊二醛為交聯劑，通過固載Ti4+，制備了一種粒徑為200nm的基于三磷酸腺苷配基的新型固定化金屬離子磁性材料。酪蛋白：血清白蛋白(1:5000)的酶解產物中仍然能夠鑒定到酪蛋白的磷酸化肽。對鼠肝線粒體中磷酸化蛋白質進行分析，同商品化TiO2材料進行比較，鑒定磷酸化蛋白質數目提高了2倍，在生物學驗證中，磷酸化肽的富集選擇性由目前的60~70%提高到90%以上。MCM2蛋白在Hca-F細胞株中為高表達;與細胞水平的生物學驗證結果一致。

　　在質譜定量分析新方法方面，發展了一種基于準等重二甲基化標記的蛋白質組相對定量新方法。在二甲基化定量方法中，由于核結合能的不同導致的質量虧損，通過高分辨率的質譜可以在MS2分辨這微小差異，進而可以在寬線性范圍內實現蛋白質組的準確定量。試驗使用¹³ CD₂O和NaCNBH₃實現Lys-C酶解產物的輕標記;CD₂O和NaCNBD₃實現Lys-C酶解產物在MS1的重標記。在MS1水平上兩者的分子量接近等重，在MS2水平上利用碎片離子存在的5.84mDa差異即可實現蛋白質組的相對定量分析。采用該方法，定量覆蓋率可以達到99%以上;定量結果與理論值相對偏差低于2%;動態范圍達到2個數量級。此外，該方法可以擴展到高達6重樣品的同時分析，顯著提高了蛋白質組定量分析的通量。

　　在質譜數據處理新方法方面，設計了一級譜峰面積和二級譜碎片離子強度結合的定量方法。將蛋白用Lys-C酶解后分別用CH₂O標記，而還原劑選擇NaCNBH₃和NaCNBD₃，兩者分子量相差4Da，通過放大母離子進入碎裂池窗口實現肽段的同時碎裂。MS1有4Da差異，可以用于定量;MS/MS存在碎片離子對也可用于定量。該方法可以提高傳統單一定量方法的準確度和定量覆蓋率。在生物學驗證中與細胞水平的生物學驗證結果一致。

　　在集成化平臺方面，開發了基于二甲基化標記的集成化蛋白質組定量分析平臺。樣品進行在線酶解后，肽段在C18捕集柱上進行二甲基化標記，并利用LC-MS/MS進行定量分析。生物學驗證中，與細胞水平的生物學驗證結果一致。

　　在提高新型離子源靈敏度上，張院士團隊研發的新型電噴霧質譜源，與商品化離子源做對比，也能將翻譯后修飾肽段的檢測靈敏度提高10倍以上。

　　SDS等去除裝置：張院士課題組研制的SDS等去除裝置，通過中空纖維膜緩沖溶液在線交換接口，實現了鹽濃度、有機溶劑濃度和PH的在線調節;可將樣品中的鹽濃度降低兩個數量級。