質粒載體和啟動子的選擇
真核表達質粒是核酸疫苗的主體，表達載體表達抗原蛋白的能力越強，誘發宿主產生的免疫應答能力越強。不同類型的啟動子/增強子、內含子序列、翻譯起始序列、轉錄終止序列、mRNA的穩定性等調控元件可直接影響基因表達效率，其中啟動子是影響核酸疫苗表達的最重要因素。RSV啟動子/增強子的表達水平比SV高1000倍，CMV啟動子/增強子的表達水平又比RSV高2倍。一般認為CMV是最理想的啟動子。強啟動子可以產生較好的免疫應答，但弱啟動子可能誘導長期的持續性免疫應答。總之，要求用作核酸疫苗的載體必須具備以下特點：在哺乳動物細胞內能高水平的表達目的基因；本身不復制；不會整合到宿主染色體中。
注射途徑與方法
核酸疫苗免疫接種的方法主要分為三種：①可產生高轉染效率的途徑，如肌肉接種；②轉染效率雖不高，但是經常被用于實驗動物接種的途徑，如皮下、腹腔內接種；③轉染效率不高，但有高水平的局部免疫監視，如皮膚、呼吸道接種。一般地，用注射器直接注射要求DNA為10～200ug槍注射要求的DNA量可少至亞納克級。Frnan用50～100ug甲型流感病毒血凝素（HA因的純DNA于0及4周各接種一次小鼠，比較了不同的注射途徑和方法對核酸疫苗的免疫效果的影響。結果發現靜脈內、腹腔內和肌肉內合并免疫及單獨肌肉內、靜脈內、鼻腔內、皮內、腹腔內和皮下免疫的各組存活率分別為95%、95%、83%、76%、75%、67%和0。說明多種途徑合并注射免疫效果最好，其它依次為肌肉內、靜脈內、鼻腔內、皮內和皮下接種。隨著技術的發展，目前最為有效的核酸疫苗免疫途徑是使用基因槍將DNA包被的金顆粒注入表皮。這種方法只需比普通注射法低2～3個數量級的DNA，即0.4ugDNA免疫2次即可產生95%的保護作用。Hui等首先報道了基因槍轉染法誘導細胞介導的免疫應答。他們以1～2KbMHC抗原基因通過外科手術暴露小鼠靶細胞后進行肌肉或脾內接種，結果產生了同樣特異的CTL應答。基因槍技術使有效的轉染與有效的抗原提呈和識別相結合。DNA包被的金顆粒射入表皮后，DNA隨之提呈細胞（APC）。此外，一些學者報道，用無針噴氣注射器的免疫效果明顯，優于常規注射器免疫。這種裝置以壓縮空氣驅動活塞，高壓下使接種物形成細流而穿過組織。臨床上已被用于肌注傳統疫苗及皮下接種藥物（胰島素）。以此法注射含報告基因的質粒后可測出報告基因的表達，雖然僅及肌注表達水平的1/10，但能同時產生針對抗原的抗體和CTL。
接種部位的預處理
Davis等報告，試驗組小鼠免疫前肌肉注射100ul10mmol/L心肌毒素，對照組注射高滲蔗糖（25%W/V，用PBS溶解），然后兩組分別接種等量HBsAgDNA疫苗。結果試驗組抗～HBs水平較對照組高10倍以上。Danko等報告，在DNA接種前7天注射0.5%～0.75%丁哌卡可使外源基因的表達提高40倍以上，它能選擇性地破壞肌細胞，引起肌細胞再生，而再生肌細胞表達外源DNA的能力高于成熟肌細胞。
接種劑量與次數
核酸疫苗的特點是在體內的表達量低，但是持續時間長。核酸疫苗在動物或臨床試驗中的免疫程序一般都是3次，大動物或人體的接種量一般為500～1000ug。多數加強免疫在小動物中可以達到增強免疫應答和獲得理想免疫保護效果的目的。Ulmer等報告，給小鼠分別注射1～100ug甲型流感病毒HA或NP DNA疫苗，結果抗～HA和抗～NP水平與接種劑量呈正相關。
免疫佐劑
免疫佐劑指與抗原同時或預先應用，能增強機體針對抗原的免疫應答能力，或改變免疫應答類型的物質，包括無機佐劑（如氫氧化鋁）、有機佐劑（如脂多糖、分支桿菌）及合成佐劑穴如雙鏈多聚肌苷酸,胞苷酸眼。近年來隨著細胞因子研究的進展，發現許多細胞因子也具有明顯的免疫佐劑效應，能增強特異抗原的免疫原性或增強機體對抗原的反應性，這些細胞因子包括IL－1、IL－2、IFN－r、GM－CSF、IL－6、 IL－12等。Weiner等用包含CpG序列（質粒骨架中含CpG序列）的DNA作為免疫佐劑和一種淋巴瘤抗原共同免疫小鼠，發現免疫后小鼠能抵抗攻毒試驗，而且CpG佐劑的毒性遠低于完全福氏佐劑，另外，CpG佐劑也能顯著提高抗腫瘤單克隆抗體在小鼠中的抗腫瘤效果。