要擴增模板DNA，首先要設計兩條寡核苷酸引物，所謂引物，實際上就是兩段與待擴增靶DNA序列互補的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴增片段的長度，兩引物的5’端決定擴增產物的兩個5’末端位置。由此可見，引物是決定PCR擴增片段長度、位置和結果的關鍵，引物設計也就更為重要。
引物設計的必要條件是與引物互補的靶DNA序列必須是已知的，兩引物之間的序列未必清楚，這兩段已知序列一般為15～20個堿基，可以用DNA合成儀合成與其對應互補的二條引物，除此之外，引物設計一般遵循的原則包括：
1．引物長度根據統計學計算，長約17個堿基的寡核苷酸序列在人的基因組中可能出現的機率的為1次。因此，引物長度一般最低不少于16個核苷酸，而最高不超過30個核苷酸，最佳長度為20～24個核苷酸。這樣短的寡核苷酸在聚合反應溫度（通過72℃）下不會形成穩定的雜合體。有時可在5’端添加不與模板互補的序列，如限制性酶切位點或啟動因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5’端生物素標記或熒光標記可用于微生物檢測等各種目的。有時引物不起作用，理由不明，可移動位置來解決。
2．（G C）%含量引物的組成應均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個引物中（G C）%含量應盡量相似，在已知擴增片段（G C）%含量時宜接近于待擴增片段，一般以40%～60%為佳。
3．引物內部應避免內部形成明顯的次級結構，尤其是發夾結構（hairpinstructures）。例如：
4．引物之間兩個引物之間不應發生互補，特別是在引物3’端，即使無法避免，其3’端互補堿基也不應大于2個堿基，否則易生成“引物二聚體”或“引物二倍體”（Primer dimer）。所謂引物二聚體實質上是在DNA聚合酶作用下，一條引物在另一條引物序列上進行延伸所形成的與二條引物長度相近的雙鏈DNA片段，是PCR常見的副產品，有時甚至成為主要產物。
另外，兩條引物之間避免有同源序列，尤為連續6個以上相同堿基的寡核苷酸片段，否則兩條引物會相互競爭模板的同一位點；同樣，引物與待擴增靶DNA或樣品DNA的其它序列也不能存在6個以上堿基的同源序列。否則，引物就會與其它位點結合，使特異擴增減少，非特異擴增增加。
5．引物3’端配對DNA聚合酶是在引物3’端添加單核苷酸，所以，引物3’端5～6個堿基與靶DNA的配對要求必須精確和嚴格，這樣才能保證PCR有效擴增。
引物設計是否合理可用PCRDESN軟件和美國PRIMER軟件進行計算機檢索來核定。
人工合成的寡核苷酸引于最好經過色譜（層析）純化或PAGE純化，以除去未能合成至全長的短鏈等雜質。純化引物在25%乙腈溶液中4℃保存可阻止微生物的生長；一般情況下，不用的引物應保存在-20℃冰箱中，在液體中引物能保存6個月，凍干后可保存1～2年。