微囊藻毒素的LCMS／MS測定

水體中微囊藻毒（MCs）的檢測方法已相對較完善，但魚類等水產品中微囊藻毒素的限量還有待進一步的研究。本文報道了同時對魚體中MC-RR、YR、LR、LW、LF進行定量分析的LC–MS/MS法，該方法具有優良的選擇性，對樣品的純化步驟要求不高，能夠在混合物中同時實現多種藻類毒素的分離和鑒定。

近幾十年由于水體富營養化程度的日益加劇，包括水源水庫水在內的淡水水體經常發生藍藻水華。有害藻類水華的頻繁發生已成為國內外普遍關注的環境問題。據2004 年資料，已從不同藻株中分離、鑒定了70多種微囊藻毒素。在已發現的藍藻毒素中，微囊藻毒（Microcystins，MCs）是一種在藍藻水華污染中出現頻率最高、造成危害最嚴重的藻毒素種類。

MCs的一般結構為環（D-丙氨酸-L-X-赤-β-甲基-D-異天冬氨酸-L-Z-Adda-D-異谷氨酸-N-甲基脫氫丙氨酸）。其中，Adda（3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6-二烯酸）是一種特殊的氨基酸。在已發現的MCs異構體中，MC-LR，RR，YR 毒性最強（L、R、Y分別代表亮氨酸、精氨酸、色氨酸）。MCs是一種水溶性肝毒素，它對動物和人類健康的潛在危害逐漸引起關注。

由于藻毒素可通過食物鏈累積，供食用的水產品如魚類、貝類等也可能攜帶藻毒素危害人類健康。為防止藻毒素對人類的進一步危害，需進行更廣泛而深入的研究。目前WHO 僅規定了飲用水中微囊藻毒素可耐受量1.0μg/L，及暫定的微囊藻毒素臨時可耐受的每日攝取量0.04 μg/（kg·d BW），結合各國微囊藻毒素的安全限量標準，微囊藻毒素每日安全攝入總量在2.4μg之內應是安全的。但魚類等水產品中微囊藻毒素的限量還有待進一步的研究。鑒于微囊藻毒素對人體的危害，應逐步建立和完善水產品中MCs含量的檢測方法，并制定食品中MCs的限量標準。

越來越多的分析技術被用于MCs的檢測當中，水體中MCs中的檢測方法已相對較完善。本文報道了同時對魚體中MC-RR、YR、LR、LW、LF進行定量分析的LC–MS/MS法，這些毒素可產生典型的離子譜，質譜儀對藻毒素有很好的分辨效果，LC–MS/MS方法由于其優良的選擇性，對樣品的純化步驟要求不高，能夠在混合物中同時實現多種藻類毒素的分離和鑒定。

實驗部分

儀器與試劑

液質聯用儀由Surveyor液相色譜系統和Thermo Fisher TSQ Quantum三重四極桿串聯質譜組成；氮氣吹干儀（美國Zymark公司）；MilliQ去離子水發生器（美國Millipore公司）；Sartorius冷凍離心機；WH-861漩渦混合器。

二次去離子水；甲醇（色譜純）；Oasis HLB固相萃取柱（Waters公司，60 mg，3 ml）；標準品：微囊藻毒素-LR（MC-RR），微囊藻毒素-LF（MC-YR），微囊藻毒素-YR（MC-LR），微囊藻毒素-RR（MC-LW），微囊藻毒素-LW（MC-LF），純度不低于95%；鯽魚樣品來自市場，冷凍保存于實驗室。

分別準確稱取標準品各10.00 mg，至10 ml棕色容量瓶，用甲醇定容，-20℃避光保存。再用甲醇稀釋上述標準儲備液，配制成1.0 μg/ml的混合標準溶液，于4℃避光保存1個月。

樣品前處理

1.提取

準確稱取5.00 g鯽魚試樣均勻樣品于100 ml離心管中，加入50?μl標準MC-RR、 YR、LR、LW、LF（1μg/ml），于液體混勻器（10000 r/min）上快速混合1 min，使標準品與試樣混合均勻，再加入10 ml甲醇溶液，均質2min，超聲15min，離心5 min（3000 r/min），將上清液轉移到試管中，氮吹至約0.5 ml，加水至約10 ml。

2.凈化

分別用5 ml甲醇、水活化HLB固相萃取小柱，流量為1~2 ml/min。將上述混合物轉移到HLB小柱上，控制流上樣流速為1~2 ml/min。用二次去離子水5ml淋洗，淋洗速度為1~2 ml/min，抽干，用甲醇溶液4 ml洗脫，洗脫流速約1 ml/min，收集洗脫液于50 ℃氮吹，甲醇-水（甲醇：水=3：7）定容至1 ml，過0.45μm的濾膜到進樣瓶中，供液相色譜-質譜儀測定。

3．液相色譜和質譜條件

3.1液相色譜條件

色譜柱：Polaris C18 色譜柱（150 mm×2.1 mm×5μm）；流動相：甲醇-0.1%（體積分數）甲酸水溶液；流速：0.25 ml/min；梯度洗脫程序：0.00min（20%甲醇，80%甲酸水溶液），4.00 min（95%甲醇，5%甲酸水溶液），8.00 min（95%甲醇，5%甲酸水溶液），8.10 min（20%甲醇，80%甲酸水溶液），10.00 min（20%甲醇，80%甲酸水溶液）；柱溫：25℃；進樣量：10μl。

3.2質譜條件

電離方式為電噴霧電離源（ESI+）；選擇反應監測（SRM）；毛細管溫度300 ℃；噴霧電壓（spray voltage）3.5 kV；鞘氣（N2）流量：6 L/min；輔助氣（N2）流量：2L/min；碰撞氣（N2）壓力：1.5 mTorr。

結果與討論

線性范圍、定量限和檢出限

將MC- RR、YR、LR、LW、LF逐級稀釋配置成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/ml系列濃度的混合標樣，在1.0~50.0 ng/ml內線性良好，當信噪比（S/N）為3時，方法檢出限分別為0.2、0.3、0.3、0.4、0.4μg/kg。以3倍信噪比、10倍信噪比分別計算檢出限和定量限，結果見表2，相關系數均大于0.99，顯示了良好的相關性。MC- RR、YR、LR、LW、LF的檢出限分別為0.7、1.0、0.8、1.2、1.3。

方法的精密度和回收率

在空白樣品中分別添加不同含量水平的MCs標準液，按樣品預處理方法處理，每個添加水平平行測定6次，LC-MS/MS檢測，結果見表3。MC-RR、YR、LR、LW、LF的回收率均大于85%，相對標準偏差范圍為6.0%~10.1%。

實際樣品分析

鯽魚樣前處理和分析參照上述條件，魚樣中均未檢測出MC-RR、YR、LR、LW、LF。