(1)原理
樣品提取液中的黃曲霉毒素被微柱管內硅鎂型吸附劑層吸附后,在波長365nm 紫外光燈下顯示藍紫色熒光環,其熒光強度與黃曲霉毒素在一定的濃度范圍內成正比例關系。若硅鎂型吸附劑層未出現藍紫色熒光,則樣品為陰性(方法靈敏度為5～10μg/kg)。由于在微柱上不能分離黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2,所以測得結果為總的黃曲霉毒素含量。
(2)試劑
①甲醇。
②甲醇-水溶液(55+45)。
③正己烷或石油醚:沸程30～60℃或60～90℃。
④三氯甲烷。
⑤丙酮。
⑥中性氧化鋁:層析用,100～200目與200～300目。
⑦酸性氧化鋁:層析用,100～200目。
⑧⑨硅鎂型吸附劑:層析用,100～200目。
⑨無水硫酸鈉:作層析用的需加工過篩成80～100目、60～100目與40～80目三種。
⑩脫脂棉。(注:作層析用的酸性與中性氧化鋁、硅鎂型吸附劑及層析用無水硫酸鈉應在110～120℃活化2h,裝瓶蓋嚴于干燥器內保存備用,保持1周左右。)
①黃曲霉毒素 B1 標準使用液:用三氯甲烷配制每毫升分別相當于0.0025μg 與0.0050μg的黃曲霉毒素 B1 標準液。
(3)儀器
①紫外光燈:100～125W,帶有波長365nm 濾光片。
②玻璃微柱管:內徑0.4cm,長12cm,為便于加液可在管的上部接一段粗的管口。
③微柱層析架:附有接受洗脫廢液的容器,要盡可能密閉。
(4)測定方法
①提取
花生油 稱取5g 混勻的樣品,置于小燒杯中。用25mL 石油醚將樣品移于100mL 分液漏斗中,再用25mL 甲醇水溶液,分次洗滌燒杯,一并加入100mL 分液漏斗中。振搖2min,待靜置分層后,將下層甲醇水溶液放入50mL 具塞量筒或比色管中。加入10mL 三氯甲烷,振蕩2min,加水至50mL,輕輕翻轉4次,以促使其分層,打開塞,待分層后,用連接水泵裝置的滴管抽去上層的甲醇-水溶液。再加水至50mL,輕輕翻轉4次,洗去殘留的甲醇。再同上法將上層水抽掉,加入4g 無水硫酸鈉,蓋嚴,間斷搖動10min,即為樣品提取液,此樣液每毫升相當于0.5g 樣品。
花生 稱取20g 磨細過10目篩孔混勻的樣品,置于250mL 具塞錐形瓶內。加100mL 甲醇-水溶液與30mL 石油醚。并在塞上涂一層水,蓋嚴防漏,振蕩30min。過濾時,先用力搖勻后,立即將樣液大量地倒入放有折疊式的約8.5cm 直徑的快速定性濾紙的漏斗中濾入50mL量筒或比色管中,注意勿將上層石油醚帶進濾液中。收集25mL 甲醇-水溶液然后加入10mL 三氯甲烷,振蕩2min 打開塞,待分層后,將上層甲醇-水抽掉,加水至50mL,輕輕顛倒4次,洗去殘留的甲醇。再同上法將上層水層抽掉,加入4g 無水硫酸鈉蓋嚴,間斷搖動10min,即為樣品提取液,此樣液每毫升相當于0.5g 樣品。
玉米 稱取20g 磨細、過20目篩孔的混勻樣品,置于250mL 具塞錐形瓶中,加入4mL水使樣品濕潤后,再加入40mL 三氯甲烷振搖30min,然后加入10g 無水硫酸鈉,搖勻放置10min,使之脫水,經折疊式快速定性濾紙濾于具塞試管中,此即樣品提取液,此樣液每毫升相當于0.5g 樣品。
②測定
微柱管I的制備(供花生油、花生提取用)取微柱管于微柱架上按先后順序加入下列各試劑,脫脂棉(作底層),1cm 80～100目無水硫酸鈉,0.5cm 硅鎂型吸附劑,0.5cm 80～100目無水硫酸鈉,1cm 中性氧化鋁,1cm酸性氧化鋁,1.5cm 40～80目無水硫酸鈉。裝管時管要垂直,每裝一種試劑要適當敲緊,兩種試劑之間界面要平,柱管要隨裝隨用,或裝好后立即放于干燥器內保存,等所需的柱裝完后再一起上樣液。以免吸附劑暴露于空氣中的時間較長,降低活性。
微柱管Ⅱ的制備(供提取玉米用)裝柱方法同微柱管I的制備方法。按先后順序加入下列各試劑,脫脂棉(作底層),0.5m 60～100目無水硫酸鈉,0.5cm 硅鎂型吸附劑,0.5cm 60～100目無水硫酸鈉,2～2.5m中性氧化鋁,1cm 60～100目無水硫酸鈉,脫脂棉(鋪頂層)。
微柱層析 取裝好的微柱管I或Ⅱ,加入1mL 提取的樣液,另取2支加入1mL 每毫升相當于0.0025μg 及0.0050μg 的標準使用液,相當于樣品的濃度依次為5μg/kg,10μg/kg 另取1支加人1mL三氯甲烷作為標準空白管,待加液流至頂層時,即加入1mL丙酮三氯甲烷展開劑(1+9)展開,在加樣或展開時,柱管均要保持垂直,待展開劑流完后,即可觀察結果,最好在2h 內進行觀察。
結果觀察與評定 在365nm 波長紫外光燈下,將層析后的樣品微柱管依次與0,0.0025μg,0.0050μg 的黃曲霉毒素B1標準柱管比較,若樣品柱管內硅鎂型吸附劑層只出現微黃色熒光環,則樣品中黃曲霉毒素含量為未檢出(在5μg/kg 或10μg/kg以下);若出現藍紫色熒光環,則表示樣品中黃曲霉毒素含量可能超過了5μg/kg 或10μg/kg,需要用其他的分析方法作進一步的測定確認。