各種細菌具有各自獨特的酶系統，因而對底物的分解能力不同，其代謝產物也不同。用生物化學方法測定這些代謝產物，可用來區別和鑒定細菌的種類。利用生物化學方法來鑒別不同細菌，稱為細菌的生物化學試驗或稱生化反應。生物化學試驗的方法很多，主要有以下幾類。
一、碳水化合物的代謝試驗
1．糖（醇、苷）類發酵試驗
（1）原理：不同種類細菌含有發酵不同糖（醇、苷）類的酶，因而對各種糖（醇、苷）類的代謝能力也有所不同，即使能分解某種糖（醇、苷）類，其代謝產物可因菌種而異。檢查細菌對培養基中所含糖（醇、苷）降解后產酸或產酸產氣的能力，可用以鑒定細菌種類。
(2)方法：在基礎培養基中（如酚紅肉湯基礎培養基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）類。所使用的糖（醇、苷）類有很多種，根據不同需要可選擇單糖、多糖或低聚糖、多元醇和環醇等，見表6-4-1。將待鑒定的純培養細菌接種入試驗培養基中，置35℃孵育箱內孵育數小時到兩周（視方法及菌種而定）后，觀察結果。若用微量發酵管，或要求培養時間較長時，應注意保持其周圍的濕度，以免培養基干燥。
(3)結果：能分解糖（醇、苷）產酸的細菌，培養基中的指示劑呈酸性反應（如酚紅變為黃色），產氣的細菌可在小倒管（Durham小管）中產生氣泡，固體培養基則產生裂隙。不分解糖則無變化。
(4)應用：糖（醇、苷）類發酵試驗，是鑒定細菌的生化反應試驗中最主要的試驗，不同細菌可發酵 不同的糖（醇、苷）類，如沙門菌可發酵葡萄糖，但不能發酵乳糖，大腸埃希菌則可發酵葡萄糖和乳糖。即便是兩種細菌均可發酵同一種糖類，其發酵結果也不盡相同，如志賀菌和大腸埃希菌均可發酵葡萄糖，但前者僅產酸，而后者則產酸、產氣，故可利用此試驗鑒別細菌。
表6-4-1 常用于細菌糖發酵試驗的糖、醇類
單糖 四碳糖：赤蘚糖 , 五碳糖：核糖 核酮糖 木糖 阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖 果糖 半乳糖 甘露糖
雙糖 蔗糖（葡萄糖＋果糖） 乳糖（葡萄糖＋半乳糖） 麥芽糖（兩分子葡萄糖）
三糖 棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖）
多糖 菊糖（多分子果糖） 淀粉
醇類 側金盞花醇 衛茅醇 甘露醇 山梨醇
非糖類 肌醇
2．葡萄糖代謝類型鑒別試驗
(1)原理：細菌在分解葡萄糖的過程中，必須有分子氧參加的，稱為氧化型；能進行無氧降解的為發酵型；不分解葡萄糖的細菌為產堿型。發酵型細菌無論在有氧或無氧環境中都能分解葡萄糖，而氧化型細菌在無氧環境中則不能分解葡萄糖。本試驗又稱氧化發酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）試驗，可用于區別細菌的代謝類型。
(2)方法：挑取少許純培養物（不要從選擇性平板中挑取）接種2支HL培養管中，在其中一管加入高度至少為0.5cm的無菌液體石蠟以隔絕空氣（作為密封管），另一管不加（作為開放管）。置35℃孵箱孵育48h以上。
(3)結果： 兩管培養基均不產酸（顏色不變）為陰性；兩管都產酸（變黃）為發酵型；加液體石蠟管不產酸，不加液體石蠟管產酸為氧化型。
(4)應用：主要用于腸桿菌科與其它非發酵菌的鑒別。腸桿菌科、弧菌科細菌為發酵型，非發酵菌為氧化型或產堿型。也可用于鑒別葡萄球菌（發酵型）與微球菌（氧化型）。