實驗
樣品描述
七種脂溶性維生素：視黃醇乙酸鹽(維生素A乙酸鹽)、視黃醇棕櫚酸鹽(維生素A棕櫚酸鹽)、α-生育酚(維生素E)、α-生育酚乙酸鹽(維生素E乙酸鹽)、麥角骨化醇(維生素D2)、維生素K1、維生素K2
(MK-4)；及兩種胡蘿卜素：番茄紅素及β-胡蘿卜素均購自西格瑪公司(Sigma Aldrich)，并且未經處理直接使用。將所有樣品以約0.1
mg/mL的溶解到甲基第三丁基醚(MTBE)中，并轉移到進樣瓶中，準備進行分析。
UPC2條件
系統： 配備PDA檢測器的ACQUITY UPC2
流速： 1 mL/min
流動相A：CO2
流動相B：乙腈
色譜柱： ACQUITY UPLC HSS C18 3.0 x 100 mm，1.8 μm
背壓： 2500 psi
柱度： 30 °C
樣品稀釋劑：MTBE
進樣量： 1μL
樣品瓶： 沃特世玻璃瓶12 x 32 mm螺紋頸瓶，2 mL
PDA掃描范圍：210 - 600 nm
數據管理： Empower 3軟件
梯度：
結果與討論
已有大量文獻闡述了利用NPLC及RPLC分離脂溶性維生素以及類胡蘿卜素的方法。1,3-5由于在分析脂溶性維生素時，通常需要使用低極性有機溶劑來溶解樣本，因此NPLC由于其與有機溶劑的相容性而具有一定優勢，可允許直接進樣脂溶性維生素或脂溶性維生素萃取物，而不需要進行蒸發步驟。RPLC法的色譜分離效率雖然高于NPLC，7但由于以下幾點原因，阻礙了其在進行FSV分析上的應用：1)分析物在流動相中溶解度較低，2)對FSV的保留力強，導致運行時間過長。最終，人們選擇使用半水性流動相(甲醇或乙腈與水的混合物)或非水性流動相；后者也稱為非水性反相(NARP) LC。7-8 UPC2，雖然常作為正相分離技術，但也同樣適用于分離極性較低的分析物。UPC2的主流動相CO2不僅是低極性分析物的良好溶劑(與己烷的極性相近)，也可與在樣品分離過程中用于溶解這些分析物的有機溶劑(例如本研究中所使用的MTBE)相同。此外，CO2的低極性也可促進分析物與流動相之間的非極性相互作用，從而縮短保留時間和運行時間。
在進行方法開發時，共選用了六種色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3、ACQUITY UPLC HSS C18、ACQUITY UPC2 HSS SB、ACQUITY UPC2 CSH氟苯基、ACQUITY UPC2 2-乙基吡啶、及ACQUITY UPC2 BEH，
以及四種溶劑，包括：異丙醇(IPA)、乙腈(ACN)、乙醇、及IPA/ACN的1：1混合液。只有使用ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱以及ACN的方法才可將非常相似的維生素K1以及K2分離。采用較低的柱溫，30 °C，原因如下：首先，為了提高K1與K2的選擇性；其次，為了最大限度地減少胡蘿卜素在色譜柱上的降解，因為胡蘿卜素非常容易氧化。
經方法優化后所得的每種成分的色譜圖以及UV譜分別如圖2及3所示。大體上，九種脂溶性維生素的洗脫順序與它們的LogP值排序相同。利用低乙腈含量(2%)的流動相就可將七種維生素全部洗脫出來，而兩種胡蘿卜素則需要使用含20%乙腈的流動相才可洗脫出來。這一現象，可由分析物的結構以及它們與流動相/固定相之間的相互作用來解釋。在九種分析物中，均存在CO2與脂溶性維生素親脂性基團之間的非極性相互作用，而七種維生素中的氧原子(呈羰基或羧基的形式)使得分析物與流動相中的乙腈之間產生極性相互作用，這樣就減少了溶離時間。而兩種胡蘿卜素分子不含有雜原子，且分子中的非極性十八烷基碳鏈更容易與固定相形成較強的相互作用，因而其溶離時間更長。
