快速蛋白質斑點印跡試驗

Tris緩沖鹽溶液(TBS)TBS+1%牛血清白蛋白TBS+0.1%Tween-20(TBST)5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸 氮藍四唑(BCIP NBT)顯色試劑鼠抗σ32單克隆抗體3RH2(MAb 3RH2)兔抗鼠免疫球蛋白G(IgG)~堿性磷酸酶綴合物

硝酸纖維素膜

材料與設備

硝酸纖維素膜（Schleicher&Schuell,Inc.)

鼠抗σ³²單克隆抗體3RH2(MAb 3RH2)

兔抗鼠免疫球蛋白G(IgG)~堿性磷酸酶綴合物

試劑

Tris緩沖鹽溶液(TBS)

TBS+1%牛血清白蛋白

TBS+0.1%Tween-20(TBST)

5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氮藍四唑(BCIP/NBT)顯色試劑

(配方，見“試劑的配制”,pp.184~189)

操作程序

1)取一小塊方形的硝酸纖維素膜打上格子，并編號。再將其置于一片紙巾上，用TBS潤濕硝酸纖維素膜和紙巾。

2)用刮勺或吸頭使硝酸纖維素膜對紙巾貼平，在硝酸纖維素膜上按格所示的位置處點1-ul樣品。

3)點樣后靜置2min,讓樣品藉毛細作用透過硝酸纖維素膜，然后將膜置于抗體/BSA溶液（鼠抗σ32MAb 3RH2和兔抗鼠IgG-堿性磷酸酶綴合物，各按1/1000稀釋于TBS+1%BSA液)中。
注：我們發現，當樣品含過量聚乙稀亞胺（PEI)時（如在PEI濃度很高情況下由FEI沉淀得到的樣品)，可引起假陽性反應，且多半是與MAb結合的。印跡在與混合杭體孵育前，于TBS+1%BSA中封閉2min,可減少這種假陽性。

4)在緩緩搖動下，與抗體結合至少6min,然后吸出上清（留樣供進一步作印跡分析用)，用TBST快速洗滌硝酸纖維素膜二次。

5)再用TBST洗硝酸纖維膜3次，每次至少1min,然后迅速用水沖洗，再加入BCIP/NBT顯色劑。

6)斑點顯色5~20mm,然后用水沖洗硝酯纖維膜，輕輕拍干，并在收入實驗記錄前使其完全干燥。