快速PCR定點突變實驗

模板 DNA

ATP dNTP 溶液 SDM 緩沖液 Taq DNA 聚合酶 克隆化的 Pfu DNA 聚合酶 Taq Extender PCR 添加劑 Dpn I 限制性內切酶 T4 DNA 連接酶 模板 DNA dsDNA 質粒 LB 瓊脂平板

FALCON 2059 管子或替代物 熱循環儀 水浴或適當的加熱裝置 提前設定為 37°C、42°C、72°C  溫箱 瓊脂糖凝膠電泳試劑和裝置

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

ATP(10 mmol/L)

dNTP 溶液（包含所有 4 種 dNTP, 每一種 6.25 mmol/L)

SDM 緩沖液，10X(20 mmol/L Tris-HCl、pH7.5,8 mmol/L MgCl₂，40ug/ml BSA)

2. 酶和酶緩沖液

Taq DNA 聚合酶

克隆化的 Pfu DNA 聚合酶（Stratagene)

Taq Extender PCR 添加劑（Stratagene)

Dpn I 限制性內切酶

T4 DNA 連接酶

3. 核酸和寡核苷酸突變引物

模板 DNA,dsDNA 質粒，小量或大量制備 [O.5pmol 模板=(0.33ug/kb)X 模板大小（kb)]
摸板 DNA 必須有甲基化的 Gm6 ATC 序列，如果沒有，在進行 PCR-SDM 之前必須在體外用 Dam 甲基化酶進行甲基化。
只有包含抑菌抗生素抗性基因（如青霉素、四環素和氯霉素）的質粒適用于這個快速方案，也能夠使用包含殺菌抗生素抗性基因（如卡那霉素和鏈霉素）的質粒，但在應用抗生素選擇之前必須使被轉化的細胞有一個生長的過程。參見第 14 步的注釋。

                                                  突變引物 [15pmol 引物=(5ng/堿基）X 引物大小（堿基）]

在一條或兩條引物上有磷酸基團十分重要，這種引物能夠被 T4 多聚核苷酸激酶磷酸化或者直接合成 5'末端磷酸基團 。

4. 培養基

LB 瓊脂平板（10 g 細菌培養用酪氨酸，5 g 細菌培養用酵母提取物，10gNaCl, 加 H₂0 至 1L, 最終 pH7.0, 每升加入 15 g 瓊脂）

5. 特殊設備

FALCON 2059 管子或替代物

熱循環儀

水浴或適當的加熱裝置，提前設定為 37℃、42℃、72℃溫箱，提前設定為 37℃

小離心管

6. 載體和菌株

E.coli 熱休克感受態細胞（例如，XLl-blue，Statagene)

7. 附加項目

選項：瓊脂糖凝膠電泳試劑和裝置，包括溴化乙錠 (參見步驟 9）

二、方法

1.PCR

(1) 冰上，在一個已滅菌好的離心管中，混合 PCR-SDM 反應物。

模板 DNA                                   0.5pmol

SDM 緩沖液，10X                        2.5ul

dNTP 溶劑（6.5 mmol/L)             1ul

突變引物                                      每種 15pmol

H₂0                                              補齊至 24ul
 
(2) 加入 2.5U 的 Taq DNA 聚合酶和 2.5U Taq Extender PCR 添加劑。
這些酶能夠混合在一起，并且能夠以 1:1(體積比）的混合物形式在-20℃ 儲存至少 3 個月。

(3) 按照如下的 PCR 條件進行 7~12 個循環的擴增。


可以根據不同種類的設備和反應體系對時間和溫度作出相應的調整，參見 31.2 PCR 注意事項。
如果熱循環儀沒有熱蓋，則要使用礦物油成石蠟來防止在 PCR 過程中反應混合物的蒸發。

2. 消化和拋光 PCR-SDM 產物

(4) 在 PCR 反應之后，將反應產物放置在冰上冷卻 2 min。

(5) 將如下的組分直接加入到 25ul 擴增產物中。

Dpn I 限制性內切酶（10U/ul)1ul
Pfu DNA 聚合酶（2.5U/ul)1ul

如果在循環中使用礦物油覆蓋在反應物上，那么在消化、拋光和連接過程中向反應管中加入附加組分的時候，一定要將微量移液器的尖端插入到礦物油層之下。

(6) 輕輕混合，然后將反應物置于一個離心管中離心 lmin。立即將反應物置于 37℃ 溫育 30 min。

(7) 將反應物置于 72℃ 再溫育 30 min。

3.PCR-SDM 產物的連接

(8) 將下列組分添加到用 Dpn I 和克隆化的 Pfu DNA 聚合酶處理過的產物中。

H₂O                                        100ul

SDM 緩沖液，10X                  10ul

ATP,10mmol/L                         5ul

(9) 輕輕混合，然后將反應物罝于一個離心管中離心 1min。
可選做：為了證明 PCR-SDM 產物的完整性，從樣品中取出 5ul 在標準的瓊脂糖凝膠電泳中分析。應該能夠觀察到單一條帶。

(10) 從上述反應物中取出 10ul 置于一個已滅菌的離心管中，加入 4U 的 T4 DNA 連接酶 (4U/ul)。

似乎不同批次的 T4 DNA 連接酶對于平端 DNA 分子的連接能力有相當的不同。這導致了突變效率的變化，在這種方法中，效率變化的范圍可以從 30%~70%。一旦發現一批質量好的酶，推薦將其保存起來專門用作 PCR-SDM。

(11) 在 37℃ 將反應物溫育1h。

4. 轉化感受態細胞（快速轉化方案）

(12) 將熱休克感受態細胞在冰上輕輕地解凍，然后取出 40ul 細胞到一個預冷的 FALCOL2059 聚丙烯管中。

(13) 向細胞中加入 1ul 連接酶處理過的 DNA，輕柔地攪拌，在冰上放置 30 min。

(14) 在 42℃ 熱激 30s，然后在冰上放置 2 min。
已經針對 FALCON2059 管優化過熱激的條件了，如果采用不同的管，反應條件應該重新做相應的優化。
如果使用的質粒包含有殺菌型抗生素抗性基因，在冰上放置 2 min 后，需要添加 260ul LB, 在 37℃、250r/min 的條件下搖動 30 min, 然后繼續第 15 步操作。

(15) 立即將所有體積的感受態細胞放置到包含有適當選擇性抗生素的 LB 瓊脂平板上涂板。將平板在 37℃ 放置過夜。

如果在循環中使用礦物油覆蓋在反應物上，那么在消化、拋光和連接過程中向反應管中加入附加組分的時候，一定要將微量移液器的尖端插入到礦物油層之下。

基因工程和蛋白質工程研究經常用到基因突變技術制備突變體，用于研究基因調控，表達和蛋白質的結構與功能。傳統的用于研究蛋白質結構與功能關系的方法有兩種：（1）對蛋白質一級結構的氨基酸殘基側鏈進行修改；（2）蛋白質晶體結構的X射線衍射。雖然這些方法能提供一定量的信息，但受到很多條件的制約，用途有限。如果采用定點突變技術在克隆DNA的預定位點導入突變，然后再適當的宿主細胞-載體系統中表達經改造的基因突變體，則可通過比較突變體蛋白與野生型蛋白的性質，鑒定出蛋白質的結構和生物學功能至關重要的結構域和個別氨基酸殘基。由于定點突變及克隆化基因的表達兩方面的發展，使得突變體研究成為生物化學家和分子生物學家分析蛋白質結構和功能的首選方案。

來源《 PCR 實驗指南（第二版）》作者：種康，瞿禮嘉。