怎么進行細胞計數？

　　確保充分的細胞生長是細胞培養和收集精確數據的一個關鍵部分。對于單層生長的細胞，融合度定義為顯微鏡觀察到被一層細胞覆蓋的培養器皿表面積的百分比。比如，50%細胞融合是指一半的培養皿/瓶等的表面被細胞覆蓋。對于懸浮細胞，通常用細胞系或類型的細胞密度衡量其生長過程，但或許也可通過濁度增加和培養基顏色穩定評估“融合“。

　　培養中的細胞生長一般發生在四個階段，如圖所示，隨著時間推移的細胞計數的對數形成一個S型曲線(S-型)，不同細胞系和培養物在每個階段需要的時間有很大差異。

　　停滯期：細胞適應培養條件的階段，細胞在此階段不分裂。細胞通常在起始培養后的24小時內附著，該階段的總時長取決于培養之初使用細胞的生長階段和接種密度。

　　對數期：細胞在此階段積極分裂，是評估群體生長和通用數據收集的最佳時間。對數期的后期，過度擁擠導致細胞脅迫之前是傳代細胞(亞培養)的最佳時機。

　　平穩期：隨著細胞達到100%融合，細胞在此階段生長放緩，不足1/10的細胞處于活躍細胞周期。細胞在此階段最容易受傷，因此需要小心觀察以確保細胞在此階段之前或之初進行傳代。

　　衰退期：細胞周期的自然組成部分。在此階段，隨著細胞死亡占據主導地位，活細胞群體數量減少。

　　在細胞培養工作中，常需要了解細胞生活狀態和鑒別細胞死活，確定細胞接種濃度和數量以及了解細胞存活率和增殖度，如用酶消化制備的細胞懸液中細胞活力的鑒別，凍存細胞復蘇后的活力檢測等。細胞懸液制備后，常用活體染料臺盼藍對細胞進行染色，進行細胞計數。臺盼藍不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色。而死亡細胞的細胞膜通透性增高，可使染料進入細胞內而使細胞著色（藍色）。準確的細胞計數對評估培養的細胞生長是至關重要，因為錯誤的計數會導致關于細胞健康的錯誤結論。細胞計數可以使用血球計數板、自動計數器進行。細胞計數一般用血細胞計數板，按白細胞計數方法進行計數，便于確定細胞的生活狀況。

　　1、所需物品

　　0.4％臺盼藍溶液

　　無水乙醇或95％乙醇溶液

　　脫脂棉

　　相差顯微鏡

　　試管、吸管、毛細吸管

　　細胞計數板

　　2、方法

　　1. 將動物細胞用PBS制備成適當濃度的細胞懸液備用。

　　2. 用無水乙醇或95％乙醇溶液擦拭計數板后，用綢布擦凈，另擦凈蓋玻片一張，把蓋片覆在計數板上面。

　　3. 用滴管吸取0.4％臺盼藍染液，按1∶1比例加入細胞懸液中。從計數板邊緣緩緩滴入，使之充滿計數板和蓋片之間的空隙中。注意不要使液體流到旁邊的凹槽中或帶有氣泡，否則要重做。稍候片刻，將計數板放在低倍鏡下（10×10倍）觀察計數。

　　4. 按圖計算計數板的四角大方格（每個大方格又分16個小方格）內的細胞數。計數時，只計數完整的細胞，若聚成一團的細胞則按一個細胞進行計數。在一個大方格中，如果有細胞位于線上，一般計下線細胞不計上線細胞，計左線細胞不計右線細胞。二次重復計數誤差不應超過±5％。鏡下觀察，凡折光性強而不著色者為活細胞，染上藍色者為死細胞。

　　5. 計完數后，需換算出每ml懸液中的細胞數。由于計數板中每一方格的面積為0.01cm2，高為0.01cm，這樣它的體積為0.0001 cm3，即0.1 mm3。由于1ml＝1000 mm3，所以每一大方格內細胞數×10,000＝細胞數/ml，故可按下式計算：

　　細胞懸液細胞數/ml＝4個大格細胞總數/4×10,000

　　6. 如計數前已稀釋，可再乘稀釋倍數。

　　7. 計數細胞后，計算細胞懸液濃度并求出存活與死亡細胞數的比例。

　　3、注意事項

　　1. 向計數板中滴細胞懸液時要干凈利落，加量要適當，過多易使蓋片漂移，或淹過蓋片則失敗，需重做；過少易出現氣泡；不理想時，應重做；

　　2. 鏡下計數時，若方格中細胞分布明顯不均，說明細胞懸液混合不均勻，需重新將細胞懸液進行混合，再重新計數。

　　3. 計數時，對于位于邊線或交界處的細胞/細胞團，遵循“計上不計下，計左不計右”的規則；

　　4. 一個細胞團計做一個細胞。

　　附：細胞活力的測定方法

　　1、將細胞懸液以0.5ml加入試管中。

　　2、加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。

　　3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。

　　4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數，計細胞活力。

　　死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。

　　活力測定可以和細胞計數合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。

　　MTT法測細胞相對數和相對活力

　　活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產生蘭色結晶狀甲贊顆粒積于細胞內和細胞周圍。其量與細胞數呈正比，也與細胞活力呈正比。

　　l、細胞懸液以1000rpm離心10分鐘，棄上清液。

　　2、沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成懸液。

　　3、37℃下保溫2小時。

　　4、加入4—5 ml酸化異丙醇（定容）。打勻。

　　5、1000 rpm離心，取上清液酶標儀或分光光度計570nm比色，酸化異丙醇調零點。

　　注意：MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。