化學法曾于很長一段時間用于常規檢查，一般包括：①抽提；②皂化；②毛地黃皂苷沉淀純化；④顯色比色四個階段。其操作復雜，干擾因素多，現多已不用，代表性的方法是省去③步驟的Abell-Kendall法，現作為標準參考方法予以利用。現臨床應用膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶及過氧化物酶的方法，快速準確，標本用量小，可完全在自動生化分析儀上操做，適于大批量標本的檢查。
膽固醇酯首先在膽固醇酯酶的催化下水解成游離膽固醇，膽固醇在膽固醇氧化酶的催化下生成過氧化氫，過氧化氫在過氧化物酶的催化下以Trinder反應顯色測定。