第二天：
將上述物品揭開，將膠正面朝下，膜正面朝上，用鉛筆作好標記。
將膠浸泡在EB中1-2分鐘，用DEPC H2O清洗，將膜放在濾紙上面，夾好，4度下保存，或者直接進行預雜交。
UV雜交（有助于RNA結合到膜上面）。
五、預雜交和雜交
預雜交和雜交 buffer： 100ul
20×SSC 25ml （5×SSC）
甲酰胺 50ml （50%）
N-lauroylsarcosine： 0.1g（0.1%）
20% SDS 100ul（0.02%）
blocking reagent 2g（2%）
DEPC H2O 25ml
（一）預雜交：
預雜交buffer 在55-65度下加熱，溫度取決于探針的質量。如果溫度低，則會得到更多非特意的條帶：對于周探針較好。如果溫度高，則會得到高結合力的條帶：探針較好。
把膜裝進一個塑料袋中，RNA在一邊，密封。
在預雜交buffer中培養，55-65度，輕搖，過夜。越長越好。但是要確保溶液蓋到膜。
（二）雜交：
buffer 在55-65度下加熱，棄去塑料袋中的預雜交buffer，將探針buffer裝進，55-65度下培養過夜，輕搖。
注意：預雜交和雜交都是在同一溫度下進行。
雜交后：
1、 清洗：室溫下用2×SSC，0.1%SDS清洗，5分鐘，2次。
2×SSC， 0.1%SDS
10 ml 20×SSC
500ul 20%SDS
加DEPC H2O 至100 ml
2、 清洗： 55-65度，用0.1-0.5 SSC清洗2次，每次15分鐘。
SSC buffer 的濃度、溫度取決于探針的質量。濃度越低、溫度越高，則會得到更高的效果。
Buffer在使用之前要先加熱。
3、清洗
室溫下用1×MA-T清洗，1分鐘，1次。
1×MA-T
100ml 10×MA
900ml DEPC H2O
3ml Tween 20 （占總的0。3%）
10×MA（室溫下儲存）
1M 順丁烯二醛
1.5M NaCl
不容易溶解，可以加入70gNaOH 調節到1L。并且調節PH=7。5
4、阻斷：
室溫下blocking buffer，30 min
blocking buffer
1g 阻斷劑
100ml 1×MA-T
稍微加熱充分溶解。
5、DIG- Ab
室溫下用Ab- blocking buffer，30 min
Ab ：blocking buffer= 1：5，000
重要：抗體離心后取出上清液
6、清洗
室溫下用1×MA-T清洗，15分鐘，2次。
7、檢測
（1）將膜用 detection buffer 培養2-3分鐘，即清洗一遍。
detection buffer
100mM Tris-HCL
100Mm NaCl
PH=9.5
（2）將膜取出，置于塑料薄膜上。
（3）用適量的CDP-Star（約1毫升），將膜均勻潤濕，涂勻，將塑料薄膜合上，中間不能有空氣和皺折。 等待5分鐘。
（4）用吸水紙將膜邊緣的CDP-Star吸去，用熱將塑料薄膜密封。
（5）檢測（暗室操作，去校醫院放射科）。
（6）分析統計。