成骨細胞原代培養實驗

采用植塊培養方法時，用少量培養液孵育，使骨組織塊貼附于培養瓶。骨組織塊浮起后觀察細胞長出情況。采用分離細胞的單層培養方法時，將松質骨切成 2~5 mm 大小，用膠原蛋白酶和胰蛋白酶消化。將混懸的細胞接種于培養瓶，用 F12 培養液培養。 

骨標本

Hams F12 培養液 用于細胞傳代的胰蛋白酶液 分離成骨細胞的消化液

Petri培養皿 培養瓶 手術刀 手術鑷

一、外植塊培養

1. 從手術室獲得骨標本。

2. 在室溫條件下，用無菌生理鹽水浸洗骨組織數次。

3. 如果骨組織不能及時使用，將骨標本放入含有 12% FBS、青霉素和硫酸鏈霉素的 Ham’s  F12 （添加 12 % FBS、2.3 mmol/L Mg^2＋、100 U/ml 青霉素和 100 ug/ml 硫酸鏈霉素）培養液中。骨標本可在 4℃條件下儲存過夜。

4 . 次日早晨，用含有 100 U/ml 青霉素和 100 ug/ml 硫酸鏈霉素的 Tyrode 液浸洗骨組織。

5. 將骨組織放入 Petri 培養皿，用手術刀和手術鑷取骨小梁，然后將骨小梁移入另一個 Petri 培養皿。

6. 加入 10 ml Tymde 液，淹蓋切除的骨小梁。用 Tyrode 液浸洗骨小梁數次，直至除去血液和脂肪細胞。

7. 為了進行植塊培養，將 2 ml 完全培養液放入 25 cm² 培養瓶，預孵育 20 min，以便用培養箱內的氣體平衡培養液。根據需要，用 CO₂、4.5% NaHCO₃ 或 HCl 調整 pH 。

8. 將骨小梁切成 1~3 mm 小塊。

9. 吸去培養瓶內的預孵育培養液，然后加入 2.5 ml 新鮮的 Ham's F12培養液。

10. 將 25~40 塊骨小梁放入培養瓶。

11. 將培養瓶直立，用接種環沿著培養瓶底壁滑動植塊，使植塊均勻分布。

12. 在 37℃條件下，將培養瓶直立放置 15 min。

13. 慢慢地使培養瓶恢復為正常的橫置位。植塊黏附于培養瓶底壁。

14. 在37℃ 條件下，將培養瓶橫置 5~7 d。此后，檢査細胞長出情況，換培養液。為了預防植塊脫離，在將培養瓶從培養箱移于超凈工作臺內或顯微鏡上之前，將培養瓶慢慢地直立起來。

15. 每周換培養液 2 次，以維持培養。

16. 細胞生長形成單層時，取出植塊，用胰蛋白酶（將 125 mg 胰蛋白酶（XI型，Sigma）溶入 50 ml 不含 Ca^2＋ 和 Mg^2＋ 的 Tyrode 液。調整 pH 至 7.0，過濾除菌。用 Pyrex 管分裝成 5 ml 和 10 ml，在 -20℃ 條件下儲藏）消化細胞。通過離心分離細胞，然后將細胞接種于培養瓶或培養皿。

二、分離細胞的單層培養

1. 用 Tymde 液反復沖洗松質骨，洗去脂肪和血細胞。在無菌條件下，用手術刀和手術鑷切除骨小梁。

2. 取到較多的骨小梁后，用 Tyrode 液浸洗 3 次，洗去遺留的血液和脂肪細胞。將骨小梁切成 2~5 mm 小塊。

3. 用含有 FCS 的 F12 培養液洗骨小梁塊。

4. 將組織塊放人盛有磁力攪拌棒的無菌小瓶內，然后加入 4 ml 消化液（分離成骨細胞的消化液：① A 液：含有 8.0 g NaCl、0.2 g KCl 和 0.05 g NaH₂PO₄ H₂O，用 100 ml 超純水配制。②B 液（膠原蛋白酶和胰蛋白酶混合液）：將 137 mg 膠原蛋白酶（Ⅰ 型，Worthington Biochemicals）和 50 mg 胰蛋白酶（Ⅲ，Sigma）溶入 10 ml A 液。調整 pH 至 7.2，然后用超純水配成 100 ml。過濾除菌后，分裝成 10 ml，在 -20℃ 條件下儲藏）。加入的消化液應淹蓋組織塊。

5. 在室溫條件下，將含有組織塊的液體攪拌 45 min。

6. 棄去細胞懸液，因為這些細胞中很可能含有成纖維細胞。

7. 加入 4 ml 消化液，在室溫條件下攪拌 30 min。

8. 收集消化液，在室溫條件下離心（580 g，2 min）。

9. 吸去上清液后，用 4 ml 含有 20 % FCS 的 Ham F12培養液混懸細胞，計數細胞。

10. 將細胞懸液離心（580 g，10 min）后，用 4 ml 完全培養液混懸細胞。將此細胞懸液作為接種物。

11. 將 75 cm² 培養瓶用 8 ml 完全 F12 培養液預孵育 20 min，以便用培養箱內的氣體平衡培養液。

12. 吸去預孵育培養液，然后加入 2 ml 完全F12培養液。

13. 加入 4 ml 細胞懸液，接種密度為 6000~10000 個/cm²。

14. 最后加入 6 ml F12培養液，使總量成為 12 ml。

15. 在分離細胞期間，向剩余的骨組織塊加入 4 ml 消化液，重復消化 30 min 。

收集分離下來的細胞。如有必要，重復消化幾次。骨組織多時，消化時間可延長至 1~3 h 。每次消化后計數細胞，將分離的細胞分別接種于培養瓶。

細胞傳代

1. 取出植入的組織塊。

2. 吸去培養液，用 D-PBSA （0.2 ml/cm²）浸洗細胞。

3. 向培養瓶加入胰蛋白酶液（0.1 ml/cm²），在 37℃ 條件下孵育，直至細胞脫離瓶壁，且細胞彼此分離。用顯微鏡觀察細胞的脫離和分離。一般孵育 10 min 即可。

4. 將分離的細胞移入離心管，然后加入等量含有 20% FCS 的 Ham F12 培養液。

5. 離心（600 g，5 min）。

6 . 吸去上清液，用完全培養液輕輕混懸細胞，反復吹打。

7 . 留兩份細胞份用于確定細胞密度，另一份用于 DNA 檢測。

8. 將剩余的細胞接種于先前用培養液平衡的培養瓶或培養皿。細胞可在 24 h 內貼壁。

1、實驗材料要新鮮，從活體分離材料后要低溫保存，并盡快進行細胞分離實驗。

2、無菌操作。操作時用的培養液，可加平時細胞培養液5倍含量的青鏈霉素。

3、用酶法分離細胞時，注意酶液的濃度和控制消化時間。

貼塊法分離細胞時，注意動作要輕柔，不要傷到細胞組織，組織塊邊緣盡量平整有利于細胞游離。

4、培養液的選擇。不同的細胞有對培養液中營養的要求不同，根據所分離細胞的特性選擇。