掃描免疫電鏡技術

實驗概要

本文介紹了掃描免疫電鏡技術的具體操作步驟，掃描免疫電鏡技術可為研究細胞或組織表面的三維結構與抗原組成的關系提供可能性。

實驗原理

免疫電鏡技術是免疫化學技術與電鏡技術結合的產物，是在超微結構水平研究和觀察抗原、抗體結合定位的一種方法學。它主要分為兩大類：一類是免疫凝集電鏡技術，即采用抗原抗體凝集反應后，再經負染色直接在電鏡下觀察；另一類則是免疫電鏡定位技術。該項技術是利用帶有特殊標記的抗體與相應抗原相結合，在電子顯微鏡下觀察，由于標準物形成一定的電子密度而指示出相應抗原所在的部位。免疫電鏡的應用，使得抗原和抗體定位的研究進入到亞細胞的水平。

實驗步驟

1. 標本處理

   1) 細胞懸液：用10ml PBS內含1mg/ml牛血清白蛋白(PBS—BSa )懸浮細胞，離心250g，5min×2。加入PBS—BSA 至10⁵-10⁶細胞/ml，振搖成單細胞懸液。BSA能減低生物標本的非特異性吸附，但注意濃度應適宜，過高會減弱特異性反應。

   2) 細胞附著于固體支持物：由于固定與免疫標記的孵育過程會引起細胞凝集，妨礙細胞表面的暴露，而且反復的離心與懸浮會導致細胞表面形態的改變。因此，通常將懸液中的細胞粘附于過濾膜或涂有帶正電荷聚合物的蓋玻片上，在粘附之前可依1)法清洗標本，以除去細胞表面的附著物。固體支持物可用涂有多聚—L—賴氨酸薄膜的載片或直徑13nm、孔徑0.22或0.45μm的過濾膜，載片制備方法：多聚—L—賴氨酸(Sigma)100μg/ml重蒸溶解涂抹于載片上，4℃30min后傾倒掉表面液體，令其自然干燥。注意載玻片事先需要清潔液浸泡，水漂洗過夜，然后浸泡于乙醇或丙醇中，用前取出自然干燥或用綢巾拭干。將細胞懸液(如細胞數少可事先離心，取沉淀細胞)，滴于濾膜或載片上，由于多聚賴氨酸的粘附性，在固定及免疫標記過程中細胞不至于脫落。但注意勿使細胞干燥。

   3) 組織切片與固體組織：組織切片如為石蠟包埋應預先脫蠟，由二甲苯經梯度酒精至水。組織切片與固體組織(勿過大)均應以PBS—BSA沖洗，并保持濕潤避免干燥。

2. 固定

   1) 固定前用PBS—BSA沖洗5min×3。

   2) 選擇加入適合的固定劑；可為4%多聚甲醛 0.1%-0.5%戊二醛在pH7.4的磷酸緩沖液中。室溫固定10-60min，或4℃30-120min。

   3) PBS—BSA沖洗5min×3。

   4) 除去殘留的自由醛基，選以下任一方法：

0.5mg硼氫化鈉/1ml PBS 10min(新鮮配制)

0.05-0.2mol/l 甘氨醊或賴氨酸—HCl/PBS 30-60min。

0.1-0.5mol/L氯化鈉/PBs 30-60min。

PBS—BSA沖洗5min×3。

3. 免疫標記與透射免疫電鏡的原則及步驟基本相同。

   1) 血細胞以PBS—BSA沖洗5min×3。

   2) 2%多聚甲醛—戊二醛混合液固定，4℃，1h

   3) PBS或TBS反復沖洗5min×3。

   4) 膠體金免疫標記程序(略)

   5) 暗室顯影液顯影

   6) 掃描電鏡樣品制樣

   7) 觀察

4. 常規掃描電鏡標本處理

   1) PBS—BSA沖洗5min×3。

   2) 后固定：2.5%戊二醛0.1mol/L磷酸緩沖液，時間視樣本大小而定，一般室溫30min左右。

   3) PBS—BSA洗5min×3。

   4) 1%四氧化鋨后固定1-2h

   5) 系列梯度乙醇或丙酮脫水

   6) 臨界點干燥或冰凍干燥

   7) 噴鍍碳與金

   8) 掃描電鏡觀察