傳統篩選合子的方法是將接合混合物涂布在選擇平板上,二倍體細胞能生長,而單倍體細胞不能生長。合子的形態學特點使我們有可能從接合的單倍體細胞群體中將它識別出來,利用顯微操作平臺使我們很容易從未接合的細胞中分離合子。
如果單倍體細胞都是新鮮培養物,接合效果最好,一般從 30°C 培養 1~2 天的平板上收集的細胞接合的效果都較好。非新鮮培養的細胞包括在 4°C 放置幾天的細胞也可以接合,但形成合子的時間會長于新鮮的培養物。
1.用無菌的牙簽分別挑取等量的 MATa 和 MATa 細胞(大小為 1~2 mm) 于 YPD 平板上,彼此毗鄰,然后將它們混勻,形成約直徑 5 mm 的菌落。
2.在 30°C 培養平板 3 h。
3.用無菌牙簽挑取接合混合物樣品,在平板的表面畫線。當平板用顯微鏡觀察時,單個細胞就可以區分。
4.合子通過細胞間的融合,而單倍體細胞因為響應接合信息素而停止生長。合子會呈啞鈴狀,容易和大的出芽單倍體細胞混淆。中間出芽的合子會有獨特的三葉形狀,因而很容易從接合混合物中分辨出來。
5.用技術和方案 22 的方法,用顯微針將合子分離至干凈的區域。
6.在 30°C 培養平板 1~2 天。
7.為了確定分出的細胞的確是二倍體細胞,將它們影印在選擇平板上。如果兩種單倍體細胞沒有明確的遺傳標記,用接合測試法則(實驗二)來確定細胞是否發生接合,正確的接合型是 MATa/MAL 二倍體。 展開 |