第一抗體的孵育時間，有較多的使用范圍，應用于臨床檢測抗體的孵育時間。一般室溫下孵育在30-60分鐘，120分鐘，對于研究性質的抗體孵育時間，也可按照上述的時間，但也有人提出于4℃冰箱中過夜孵育，根據我們的經驗一般不主張于4℃冰箱中過夜，原因是：
1.長時間的孵育可以使一些非特異性的物質沉淀下來，或者被吸附，造成背景的染色。
2.目前銷售的抗體，純度較高，特異性較強，不需要長時間的孵育，也能夠結合得很好 。
3.長時間的孵育，較容易引起切片的脫落，造成染色的失敗。
4.長時間的孵育，不利于臨床病理報告的發出。
X、連接抗體的選用必須正確，否則可造成假陰性的現象。
免疫組化染色方法較多，如ABC法，SP法和EV二步法等，如果使用的是SP法，或者ABC法，這時就必須要仔細地選擇好連接抗體，第一抗體有單克和多克隆炎分，連接抗體則要根據選用的抗體來進行，例如：第一抗體選用的是單克隆鼠抗人**抗體，連接抗體也要選擇相應的免抗鼠IgG，這樣才能連接上（目前生產廠家已生產出混合型抗體，即既適合于單克隆抗體，也適合于多克隆抗體。使用者不用擔心連接不上，隨便使用都可，但如果沒有訂購混合型的試劑盒，就必須注意的型號，使之完全適合所選用的抗體。）孵育的時間可在10分鐘，20分鐘或者30分鐘，一般在室溫中進行，如果室溫低于20℃以下，則可在37℃的孵育箱中進行。
XI、復合物的使用及孵育時間的確定。
各種方法有各自的復合物，如ABC法，復合物是卵白素和生物素結合的復合物，再帶有HRP，SP法，（LsAB法）的復合物是鏈雪菌素蛋白復合物，再帶有HRP，EV二步法的復合物則是二抗和三抗連接在一起的復合物，再帶上HRP，除此之外，根據水解底物的不同，可產生不同的顏色，例如：帶有HRP的酶，水解的底物一般為DAB產生黃棕色，帶AP的酶，水解的底物一般為AEC產生紅色。
XII、PBS的沖洗
免疫組化的染色過程，除了前面的處理和加入的抗體外，都在PBS的沖沖洗洗中度過，PBS沖洗的正確與否，也是導致最后結果的關鍵。
1.單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。
臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類及項目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們在一個缸內洗，這樣就會造成交叉污染，影響最后的結果。正確的做法是單獨地進行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒有相互交叉污染的機會。
2.溫柔沖洗，防止切片的脫落。
沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來，不要拿起切片將PBS對準切片沖洗，這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動，導致切片的脫落。
3.沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。
沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結合的各種物，使之不產生背景，此種做法一是浪費時間，二是很容易導致切片的脫落。切片的沖洗據實踐認為，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結合的物質，無需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS，持續2分鐘左右就完全足夠了。
4.PBS的PH和離子強度的使用和要求。
劉彥仿指出：中性及弱堿性條件（PH7－8）有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解。[]免疫組化P56我們目前常用的PBS的PH在7.4-7.6濃度是0.01M，根據本室十幾年來的使用情況，認為該溶液價格便宜配制方面，使用效果好。
5.常用試劑的配制和使用。
在免疫組織化學的染色過程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因為切片在整個染色中，抗體的加，換，切片的沖洗，DAB的配制都離不開緩沖液。可見緩沖液在整個染色中都起至關鍵的作用，緩沖液的過酸或偏堿，都將影響染色的結果。下面將介紹有關方面的內容：