抗原呈遞細胞的選擇和制備（一）

基本方案 過 利 斯 特 氏 菌 刺 激 制 備 腹 腔 巨 噬 細 胞

材 料

單核細胞增多性利斯特氏菌

無 菌 PBS

H -2 相 合 小 鼠（見 表 A .2A .1)，包括正常和提前 3 周注射了利斯特氏菌的小鼠

V冰浴的 D M E M 培養基

3 % (V A O 乙酸

0.4% (m /V ) 臺盼藍染液

V D M E M -1 0 完 全 培 養 基（室溫以及 37°C )

7 0 % (V7 V ) 乙醇

IOml 和 30m l 的注射器以及 23 G 針頭

離心機
9 6 孔培養板

移液器

顯微鏡

1 . 在 50m l 離心管內將利斯特氏菌用 P B S 稀釋至合適濃度，此 時 0.5?1.0m l 菌液中含半數致死量 5 % ?1 0 % 的 細 菌（一 般 情 況 下 C B A /J 小 鼠 或 C 57B L / 6 小 鼠 需 IO⁵ 個細菌/m l ， B A L B /c 小鼠需 IO⁴ 個細菌/ml)。蓋緊離心管蓋后搖勻。用 IOml 注射器抽取稀釋過的上清。

2 . 用 23 G 針 頭 將 0.5?1.0m l 細菌懸液注射人 H -2 相合小鼠腹腔。根 據 步 驟 6 計算出制備足夠用細胞所需小鼠數量。

3.7?Ild 后 收 集 腹 腔 細 胞（單 元 6.1)。用 冰 浴 的 D M E M 收集細胞以防止巨噬細胞黏附在管壁上。

4 . 將收集的細胞懸液置于 50m l 離心管， 4°C ， 400?500 g 離 心 lOmin，收集細胞并重懸于 0.5m l 預 冷 的 D M E M 中。

5 . 吸取少量細胞懸液并以 1 : 5 (W F ) 懸 浮 于 3 % 的乙酸溶液中，以溶解紅細胞。加入等量的臺盼藍染液并計數活細胞（見 附 錄 3C ，細胞數量應達到 I X l O ⁷?2 X 10⁷ 個
細胞/ml)。

6 . 在離心管內加入 D M E M -1 0 完全培養基，將細胞濃度調節至 2X 10⁶個細胞/m l 。如果血清濃度達不到 8 % ?9 % ，可離心細胞棄上清后直接用 D M E M -I O 完全培養基稀釋
至 2 X 10⁶ 個細胞/ml。將腹腔細胞轉移至 9 6 孔培養板培養， IOUl/孔（2 X 10⁵個細胞/孔）。

7.37°C 培 養 2 h 或 稍 長 時 間（但不可過夜）以便巨噬細胞貼壁。

8 . 用多道移液器反復輕柔地吹打細胞，吸棄懸浮細胞后加入 37°C 預 熱 的 D M E M -I O 完全培養基。注意操作宜輕柔且不能觸碰到貼壁細胞。

9 . 在顯微鏡下檢查細胞。分離的細胞若在 I d 內使用，就無需用 IFN-7 進一步活化。

備 選 方 案 1 連續注射利斯特氏菌和豚蛋白胨后制備腹腔巨噬細胞

此法可以較前法制備更多數量的小鼠腹腔巨噬細胞，但需要給小鼠多注射一次，且需要在更短的時間內收集巨噬細胞。此過程與前述基本方案基本相同，只是在初次注射細 菌 7?IOd 后 ，直接給小鼠腹腔一次性注射 I m l 高壓滅菌消毒的溶解于水的 1 0 % (V /V )豚蛋白胨。 3d 后如前述收集細胞（見基本方案，步 驟 3?9)。

輔 助 方 案 1 小鼠腹腔注射用利斯特氏菌的制備

材 料

4 只 小 鼠（如 C B A /J)

培養單核細胞增生性利斯特氏菌（見 單 元 6. 6)

無 菌 PBS

I O O m m 無菌腦心浸液瓊脂板

無菌腦心浸液培養基

細菌凍存液：溶 解 于 P B S 的 2 0 % (V /V ) 甘油，蒸汽消毒后 4°C 保存

70um 無菌尼龍濾網

50m l 離心管

無菌細菌涂布器

37°C 培養箱

無菌接種環

560n m 分光光度計

高速離心機以及無菌帶蓋離心管

Sorvall R C -5 離心機及 G S A 轉子

I m l 凍存管

1 . 將適量利斯特氏菌注射至 2 只小鼠腹腔，以便通過體內途徑獲得利斯特氏菌并確保其毒力。如 對 于 C B A / J 小 鼠 ，可 使 用 IO6 個細菌/鼠。 2d 后處死小鼠，取出脾臟并制備脾細胞懸液，通 過 70 Mm 無菌尼龍濾網后將細胞置于 50m l 離心管。另 取 2 只小鼠作為對照。

也可以不通過體內傳代，直接從腦心浸液瓊脂板挑取利斯特氏菌克隆，參照步驟 3 接種至腦心浸液肉湯。

2.用 P B S 梯度稀釋脾細胞懸液（1 : 10、 1 : 100、 1 : 1 0 0 0 ) 并 將 IOOm I 各組稀釋細胞懸液分別置于 I O O m m 無菌腦心浸液瓊脂板，用無菌細菌涂布器將細胞涂布均勻。置于 37°C 培養箱培養過夜。計數每塊培養板的克隆數。確認涂布對照小鼠脾細胞板不形成克隆，且涂布實驗小鼠脾細胞板形成大量克隆（對 于 1 : 1 0 0 稀釋的細胞，每塊培養板應獲得 10?100 個克隆）。

3 . 用接種環從培養板挑取 4 個 典 型 克 隆 并 分 別 轉 移 至 20m l 無菌腦心浸液培養基中(50m l 離心管）。注意每次挑取克隆時接種環均需滅菌。加蓋混勻。

4a. 制備當天細菌培養物：將 試 管 置 37°C 培養，每 30m i n 搖動一次。 3 h 后 ，定 時（比如每小時）取少量菌液通過分光光度計檢測其 O D 值 。當 O D 值均達到 0.17 時停止培 養（約 需 4 h)，從中取一管再擴增。

4b. 制備隔夜細菌培養物：將 試 管 于 37°C 靜 置 培 養 過 夜（試管蓋無需蓋緊）。第二 天 ，將試管內的菌液以 1 : 1000 稀釋至無菌腦心浸液培養基，培 養 至 O D 值 達 到 0.5?1.0 (約需 8 h)。

5 . 將菌液置 4°C 保 存（每 份 0.5 ml)。如方便，可于第二天確認培養物中是否含有利斯特氏菌。此外 ，利斯特氏菌能在 4°C 存活并擴增。對于隔夜培養的細菌，進 入 步 驟 7操作。

6 . 經過篩選后，將含有細菌的 15?130m l 腦心浸液培養基轉移至無菌高速離心管，將其固定在搖床的樣品架上，在 37°C 緩慢搖動培養，定時檢測 O D 56c 5 值 ，并 在 O D 56。值達 到 0.5?L O 時 停 止 培 養（約 需 5 h)。

7.700g離 心 細 菌 6 min。在此過程需非常小心：因為培養物里含有大量細菌。將細菌懸 浮 于 IOml 凍存液中。

8 . 檢測細菌的 O D 56。值（可 通 過 1 : 2 0 稀釋后檢測），將細菌的濃度調節至 I X l O⁷?IO⁸個細菌/ml (O D 56。值 為 1 時細菌量約為 5 X 10⁸)。將 細 菌 分 裝（0.1?Iml) 保存于一80°C ，可以保存 3 年以上。每次解凍后使用，應避免反復凍融。