作者：陳英劍 李芳秋
摘要 以ｒｈＣｙＰＡ為包被抗原，用間接ＥＬＩＳＡ檢測了４５例ＳＬＥ病人血漿抗ＣｙＰＡ自身抗體的ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ三種類型，并探討了此抗體與多項臨床指標的相關性。結果顯示，ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ三類抗ＣｙＰＡ自身抗體的陽性率分別為３６％，２０％，１８％，總陽性率為４８％。存在皮膚粘膜損害、白細胞減少、發熱、并聯能表現或活動期的ＳＬＥ病人抗ＣｙＰＡ自身抗體陽性率明顯高于無相應癥狀或非活動期ＳＬＥ病人。
An investigation of relation between anti-CyP A autoantibody and SLE
CHEN Yingjian,LI Fangqiu,YU Wei, WU Jianguo
(Center of Medical Laboratory Science of PLA,Nanjing General Hospital of Nanjing Command,Nanjing 210002)
Abstract 45 patients with systemic lupus erythematosus(SLE)were studied for IgG,IgA and IgM anti-cyclophilin A autoantibodies using indirect ELISA and rhCyPA as coating antigen.It was investigated that the relation between these antibodies and several clinical indexes.Anticyclophilin autoantibodies were found in 48% of the SLE patients. The positive rate of IgG, IgA and IgM anti-cyclophilin A antibody is 36%, 20% and 18%, respectively. The prevelance of antibodies to CyPA in patients with skin and mucous lesion, leukopenia, fever, arthralgia or active SLE were statistically higher compared with patients without these clinical manifestations or inactive SLE.
Keywords rhCyP A；SLE；Anti-CyP A autoantibody
Cyclophilin(CyP)是環孢素A的受體,也是肽脯氨酰順反異構酶PPIase三家族成員之。CyP家族包括多種成員，其中CyP A是含量最多、最主要的一種。它在生物界廣泛存在，結構保守，在細胞的生命活動中扮演著重要的角色［1］。以CyP A為靶抗原的自身抗體—抗CyP A自身抗體最早由Harigi等人于1992年發現［2］。研究表明，SLE病人血清抗CyP A抗體陽性率較高，且與疾病的活動性和某些特定的臨床表現相關。
本實驗室證實了抗CyP A自身抗體在SLE病人中有較高的陽性率(53.3%［3］，50.5%［4］)，還發現在其他的自身免疫性疾病也有一定的陽性率，但與者相比則低得多。盡管不能說此抗體是SLE的特異性抗體，但它的陽性率之高值得重視。對抗體進行分類發現，IgG、A、M三種類型的抗體都存在［5］。本研究檢測了45例SLE病人抗CyP A自身抗體的三種類型，并進一步探討了此抗體與SLE疾病表現和活動性的關系。
1 對象與方法
1.1 病人 SLE患者45例，由南京大學醫學院附屬鼓樓醫院免疫科、山東醫科大學附屬醫院風濕免疫科及本院腎臟病科共同提供，均符合1982年美國風濕病學會SLE診斷標準。其中女41例，男4例，平均年齡28.88(12～62)歲，平均病程3.6年(3月～17.5年)。南京市紅十字會中心血站健康獻血員40例作為正常對照。
1.2 標本 靜脈取血,肝素抗凝,2小時內離心分離血漿,分裝凍存于－20℃備用。避免反復凍融。
1.3 SLE活動性判斷 記錄收集標本時病人的臨床表現及各項實驗室指標，采用補充的Chubick法［6］判斷疾病的活動性，≥4分為活動組，≥8分為重度活動組。
1.4 主要試劑及儀器 (1)rhCyP A：pET11/CyP A轉化的大腸埃希菌BL21(DE3)常規培養表達[7]。收集菌體，超聲裂解，離心取上清。50%飽和硫酸銨鹽析，離心后沉淀用pH 7.8的Tris-HCl溶液溶解，對同種溶液透析，至透析液無NH+4存在。透析后粗提蛋白液行DEAE-Sepharose CL-4B柱層析，收集流穿蛋白，即rhCyP A，冷凍干燥保存。HPLC測得純度＞95%，SDS-PAGE顯示為單一條帶，分子量與標準CyP A(Boehringer Mannheim公司產品)一致。(2)HRP標記的抗人γ鏈F(ab′)2、μ鏈F(ab′)2、α鏈F(ab′)2，為本科自制。(3)酶聯免疫檢測儀(Bio Rad)。
1.5 方法 采用間接ELISA。rhCyP A(1 μg/ml)作包被抗原，用10%新生小牛血清封閉。標本1:50稀釋，一式三份，同時設陰、陽與空白對照。酶標抗人γ鏈F(ab′)2、μ鏈F(ab′)2、α鏈F(ab′)2分別1:800，1:4000，1:1000稀釋。加樣量均為100 μl/孔，置37℃反應1 h。底物用TMB-H2O2，37℃避光顯色10 min，2 mol/L H2SO4終止反應，空白調零，讀取450 nm波長吸光度。以正常對照組吸光度的平均值加兩倍標準差(
1.6 統計學處理 采用χ2檢驗。
2 結果
2.1 45例SLE病人中22例抗CyP A自身抗體陽性，陽性率為48%，而40例正常對照中只1例陽性，陽性率為2.5%。兩者相比差異非常顯著(P＜0.01)。三類Ig(G、A、M)抗體的陽性率分別為36%(16/45)，20%(9/45)，18%(8/45)。
2.2 用補充的Chubick法判斷，45例SLE病人中有27例處于活動期，抗CyP A自身抗體陽性率為63%(17/27)，與非活動組(28%，5/18)差別顯著(P＜0.05)。其中重度活動組有12例，抗體陽性率75%(9/12)，與非重度活動組(53%，8/15)相比無統計學差異(P＞0.05)。SLE病人各項臨床表現與抗CyP A抗體的關系見表1。
表1 SLE病人臨床表現與抗CyP A抗體的關系
Table1 Relation between clinical manifestation of SLE and anti-CyP A autoantibody
Compared with patients without corresponding clinical manifestation *P＜0.05,**P＜0.013
討論
SLE是典型自身免疫病，病變涉及組織與器官，存在多種免疫學異常其中典型特征就是體內產生多種針對正常細胞不同成份的自身抗體。些抗體又對疾病產生這樣那樣的影響。已證實其中一些自身抗體與特定的疾病表現有相關性［8］。如抗磷脂自身抗體與血栓形成，抗紅細胞抗體和抗血小板抗體與溶血性貧血和血小板減少，抗ds-DNA抗體與腎臟病變，抗Sm、抗RNP抗體與雷諾現象和肌炎有關等。
本研究表明，48%的SLE病人體內產生了抗CyP A抗體，顯著高于正常對照組。且此抗體的出現多伴有皮膚粘膜損害、關節痛、發熱和白細胞減少，與Harigi報道結果基本一致。活動性SLE病人抗CyP A抗體的陽性率明顯高于非活動組，但重度活動組與非重度活動組相比抗體陽性率未發現明顯差別。具體到抗體類型來看，發熱與IgG、IgA類抗體，皮膚粘膜損害與IgG、IgA類抗體，關節痛與IgM、IgA類抗體關系比較密切。
抗CyP A自身抗體的產生機制尚未闡明。考慮到CyP A在自然界的廣泛存在，有人提出了分子模擬的假說。而由于SLE病人免疫系統的紊亂使之比正常人易產生抗CyP A自身抗體。雖然說自身抗體對自身免疫病的發生發展意義重，但大多自身抗體的作用機理并不清楚。單從抗CyP A抗體來看，它的靶抗原CyP A是一各組織細胞都廣泛存在的蛋白質。正常大腦皮層含量最高(2.8 μg/mg蛋白)，皮膚含量較低(0.8 μg/mg蛋白)［9］，白細胞約含(2.3 μg/mg蛋白)［10］，腎臟也在2 μg/mg蛋白以上。從CyP A含量似可考慮白細胞減少與抗CyP A自身抗體有聯系，但卻無法解釋皮膚粘膜損害與抗CyP A自身抗體的相關性。最近我們證實血管內皮細胞CyP A含量豐富(待發表)，也未發現此抗體與血管炎有相關性。這或許與CyP A存在主要和次要兩種形式，而不同組織細胞中所含比例不同有一定的關系。另外，由于CyP A存在于胞漿內，目止尚無抗CyP A自身抗體穿入細胞及特異性CyP A免疫復合物在病變部位沉積的證據，要得出抗CyP A自身抗體參與SLE病人的皮膚粘膜損害、白細胞減少以及關節病變的結論還為時過早。但抗CyP A自身抗體的檢測或許可以作為一考察疾病活動性的參考指標。
*江蘇省自然科學基金資助項目
**第二軍醫大學碩士研究生
參考文獻
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