拉曼光譜在生命科學領域的應用

拉曼光譜作為一種無損、非接觸的快速檢測技術，已吸引廣大科研人員的關注，并被應用于各行各業中。特別是在生命科學領域，由于拉曼樣品用量很少，不需要對生物樣品進行固定、脫水、包埋、切片、染色、標記等繁瑣的前處理程序，不僅操作簡單，而且不會損傷樣品從而能夠獲得樣品最真實的信息。

另外，生物大分子多是處在水溶液環境中，研究它們在水溶液中的結構對于了解生物大分子的結構與性能的關系非常重要。由于水的紅外吸收很強，因此用紅外光譜研究生物體系有很大局限性，而水的拉曼散射很弱，干擾小，而且單細胞拉曼光譜能提供細胞內核酸、蛋白質、脂質含量等大量信息，可在不損傷細胞的條件下實時動態地監測細胞分子結構變化，可以對細胞、病毒等進行原位檢測分析。

基于上述優勢，拉曼光譜在生命科學領域有著大量的研究工作，諸如基礎研究、生物醫學、藥物、化妝品以及食品中都有著廣泛的應用。HORIBA Scientific開發的系列拉曼光譜儀，適合于各種生命科學研究。

1.      基礎研究

基礎研究包括組織結構及成分鑒別（脂類、蛋白質、糖類、水、DNA，RNA等）、細胞的定位、鑒別及分類等。

生物大分子中，蛋白質、核酸、磷脂等是重要的生命基礎物質，研究它們的結構、構象等化學問題以闡明生命的奧秘是當今極為重要的研究課題。拉曼是分子的“指紋圖譜”，生物分子的指紋區主要出現在100-2000cm-1。拉曼對分子所處的環境非常敏感，結構上的些微差異都能在拉曼譜圖上體現出來。

細胞是生命最基本的組成，是一切生命現象的基礎。共聚焦顯微拉曼光譜的發展對原位活細胞研究有著重要意義，對于小尺寸的樣品，如尺寸僅僅為1~2μm的細菌，通過真共焦的良好共焦特性，依然可以對其進行詳細研究。

另外，細胞種類繁多，如細菌有不同的菌種。通常，采用一些多元統計學方法，如聚類分析、主成分分析、判別分析等可以更好地對研究對象進行評價。圖3是對3種不同的細菌在不同生長時間下獲得的拉曼結果進行的統計分析，結果顯示對于同一細菌，盡管生長時間不一樣，但是它們都被歸屬于同一類，證明拉曼可以很好地鑒別不同種類的細胞。

2.      生物醫學

拉曼光譜在生物組織與疾病中的研究非常廣泛，涵蓋了幾乎所有的軟組織和硬組織，如腦組織、肺組織、肝組織、骨組織等。在很多空腔組織如肺、胃、結腸等中，可以將光纖包埋在內窺鏡中實現拉曼光譜的活體實時檢測。

拉曼光譜可以從分子水平提供信息，這對于很多疾病的研究有著重要的意義。不同病變會在拉曼譜圖中有不同的特征顯示，通過拉曼光譜能夠對不同疾病進行判斷。

此外，當疾病還處于早期階段，組織結構上未見病變時，通過拉曼光譜的研究可以得到一些早期的病變信息。傳統的癌癥檢測手段是病理標本染色法，但是這種方法只能檢測出與健康組織有明顯區別的病變組織，當疾病還處于隱形階段時則很難檢測出來，這也是為什么發現癌癥一般都是晚期的原因。

而拉曼可以獲得細微的化學結構信息，即使是早期腫瘤，由于其DNA含量會急劇增加，拉曼可以捕捉到這些變化。如圖5中早期腫瘤（綠色）和晚期腫瘤（紅色）的DNA拉曼峰強要明顯高于健康組織（胼胝體，皮質和血液）。拉曼成像圖中紅色區域的晚期腫瘤與染色法診斷出的病理學吻合，而綠色區域的拉曼譜圖與紅色區域的譜圖一致，說明已經發生病變，然而染色法卻沒有將其檢測出來。

3.      藥物

在藥物配方中，通常除了有效成分之外，還包含很多輔料。而原料和輔料的分布對藥物的溶解、吸收等一系列效應有著重要影響。根據拉曼光譜中不同成分信息的提取可以得到藥片成分分布的圖像，如圖6。通過一些新的成像技術，如SWIFTTM高速共焦光譜成像配合DuoScan的應用，可以在短時間內對整個藥片進行成像分析。

顯微拉曼可以獲得藥片表面各成分的分布信息，而透射拉曼則能獲得整個藥片的平均信息，可以對整個藥片進行準確的定性、定量分析，從而能夠測定不同批次或不同廠家藥物含量的均勻度、進行真假藥鑒定、過程監控排錯等。圖7是使用透射拉曼結合化學計量學方法對藥片進行的定性、定量分析。

其中左圖樣品是含2種不同晶型藥物的膠囊，每種膠囊取6個樣品，結果顯示主成分分析法能有效區分開膠囊中晶型的差別；右圖樣品是28個含有不同主成分含量的藥片（共7種含量，每種含量各4個樣品），使用偏最小二乘法對其進行定量分析發現結果具有非常好的線性。

由于拉曼光譜是無損的檢測方法，它還可以用于藥物與細胞之間相互作用的研究。如藥物與細胞作用的位點、在細胞中的分布、藥 物在細胞內的動力學研究等等。因此，拉曼光譜也在藥物的篩選等工作中有著廣泛應用。圖8是藥物作用于細胞后的拉曼成像結果，其中綠色是純藥物的分布位置，紫色、藍色和粉色分別是藥物作用于細胞膜、細胞質和DNA形成復合物后的成分分布圖。最后一張是所有成分分布的疊加。

4.      化妝品

大部分化妝品是直接和人體接觸的，它們的安全性以及效果備受人們關注，無損的實時檢測更是對此行業有著重要意義。

由于拉曼光譜無侵入無損傷，可直接對志愿者的皮膚進行檢測研究，能夠實時的監測產品效果。通過共聚焦拉曼光譜儀可以對皮膚含水量進行深度分析，如圖9所示，在不同深度處皮膚的含水量不同，并且在涂抹保濕霜后在不同深度有不同的變化。由此可以判斷保濕霜的效果。染發護發產品的穿透效果深受各大品牌關注。將拉曼光譜應用于產品作用于頭發的效果研究，可以通過產品的特征譜帶追蹤產品的穿透深度，從而對產品的效果進行判斷。

此外，很多化妝品都是乳液，其乳滴的穩定性、有效成分在乳滴中分布的均勻性等都是影響化妝品質量的重要因素。拉曼成像可以獲得化妝品乳液中顆粒或相態分布、乳滴中的成分分布等信息，如圖10，從而在化妝品的研發和質量控制中有著重要的作用。

5.      食品

蘇丹紅、三聚氰胺、瘦肉精等一系列事件迫使人們越來越關注食品安全這個與健康密切聯系的議題。拉曼光譜作為一種無需樣品前處理、靈敏度相對較高、分析測試快速便捷的綠色光譜技術，對于食品質量檢測[2]、食品中細菌鑒別[3]及食品加工[4]等都有重要應用。

很多同類食品的結構非常相似，如食用油都是脂肪酸，但是動物食用油主要是飽和脂肪酸，而植物油主要是不飽和脂肪酸。對于這些結構相似的化合物，使用化學計量學方法可以有效地將它們區分開，如圖11中的硬脂酸甘油酯，1#樣品含不飽和脂肪酸甘油酯，而2#樣品是飽和脂肪酸甘油酯，兩種樣品各取6個點，經主成分分析法歸類后發現，拉曼可以區分開這兩種非常相近的樣品。

2007年美國發生多起貓、狗寵物中毒死亡事件，經拉曼研究分析發現貓糧中的三聚氰胺和三聚氰酸可以在腎組織中形成復合物晶體，阻塞腎小管內腔，量多嚴重者可致死。圖12是貓服用三聚氰胺、三聚氰酸添加貓糧后在腎中形成復合物晶體的拉曼分析結果[5]，A是貓腎顯微圖像，B是腎中形成的結晶，其中黑色框是拉曼成像位置，C是成像區域的拉曼圖，D是偽彩色顯示的拉曼強度分布圖，E、F是體外模擬實驗得到的復合物拉曼譜圖和顯微圖。實驗結果顯示貓腎中形成的結晶與體外合成得到的結晶成分一致。

拉曼光譜還可以用于食品產地、品質等各方面的判定與研究。以玉米為例，種子中的淀粉、蛋白質、脂類含量決定了玉米的品質，通過拉曼光譜成像可以獲得玉米中不同成分的分布圖。

小結

拉曼光譜作為一種無損無標記的分析方法，它能夠從分子層面對生命科學領域的樣品提供豐富的信息。共聚焦技術、新的成像方法為此項技術在生物領域的應用提供了堅實的技術支持。近年來國內外研究者將拉曼光譜應用于細胞藥物處理、細胞水平疾病診斷、單細胞生命活動監測、亞細胞結構等研究，取得了不同程度的進展。隨著研究的深入,拉曼光譜分析技術必將在于細胞，癌癥研究、細胞分選、藥物篩選、食品安全等生命科學領域大有作為。