探針合成實驗

基因

轉錄緩沖液 DTT RNA酶抑制劑 CTP ATP GTP S-UTP 乙酸銨 乙酸銨 乙醇

水浴鍋 離心機 培養箱 烘箱

1.  在一個含SP6、T3或T7啟動子的載體中，插入目的基因。在編碼序列下游酶切使質粒呈線性。DNA以酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，70%乙醇洗后晾干。以無菌水重溶沉淀至1 μg/μl。

2.  室溫配罝如下反應混合液（總體積20 μl）：
（1）4.0 μl 5×轉錄緩沖液

（2）0.2 μl 1 mol/l DTT

（3）60 U RNA酶抑制劑

（4）1.0 μl 三種10 mmol/l NTP中的每一種

（5）1.0 μl 1 μg/μl 酶切DNA

（6）10.0 μl ［³⁵S］UTP

（7）16 U SP6或T7 RNA聚合酶

（8）37℃溫育30 min，再加16 U聚合酶并于37 ℃溫育40 min。
 

3.  在反應混合液中加入：60 U RNA酶抑制劑，20 μl 10 mg/ml 的載體RNA和1.0 μl 酶1，于37℃溫育10 min 以除去摸板。

4.  往反應混合液加入以下液體：0.8 μl 1 mol/l DTT、63 μl 無菌水和10 μl 3 mol/l 乙酸鈉，取出1 μl 測定其 cpm/μl 值。

5.  加36.4 μl 7.5 mol/l的乙酸銨于反應混合液（終濃度2 mol/l）加50~100 μg tRNA載體和272 μl 冷無水乙醇，置干冰上沉淀10 min，以冷70%乙醇洗沉淀，晾干，需要的話可重復此步。以100 μl 10 mmol/l DTT重溶DNA沉淀。

6.  確定其 cpm/μl 值，并計算摻入百分比，核糖核酸探針應于2~3天內使用。 （70%到90%的標記摻入，結果可得70~90 ng 標記的RNA）。