02、組學生信分析
發現糖尿病小鼠胰島中信號通路重構
為了探討調控磷酸化蛋白質組水平變化的機制，作者對db/db胰島中顯著變化的激酶底物motif進行分析（圖2A）。結果顯示，與高營養素誘導mTOR激活一致，p70S6K底物motif顯著富集，而AMPK motif下調表達。其他激酶motif，如ERK1/2和AKT同樣下調表達（圖2B）。此外，調節胰島素分泌包括PKA、PKC和CaMK幾種主要激酶的motif下調表達，該結果表明胰島β細胞在高葡萄糖誘導后不能正常分泌胰島素。
作者進一步想了解在胰島細胞缺陷條件下信號通路如何整體重新布局。db/db胰島中PKA和PKC底物發生顯著的去磷酸化， 其催化底物的表達水平減少（圖2C）。糖尿病胰島中，高營養水平誘導mTOR通路激活，進而通過p70S6K-IRS1/2負反饋弧導致AKT抑制。AKT活性降低進而引起其直接作用底物磷酸化水平的降低，GSK-3β是AKT的重要底物，其活性受AKT的負調節。結果顯示，在db/db胰島中，GSK-3β的Ser9磷酸化抑制，同樣地GSK-3β 的Tyr216的酪氨酸磷酸化水平顯著上調，該結果進一步證實GSK-3β在糖尿病胰島中活性增加。PDX1 的是GSK3 β 和HIPK2直接作用底物，后者通過磷酸化Ser269可引起該蛋白進行蛋白酶體降解。結果顯示，糖尿病胰島中，PDX1的Ser269的磷酸化水平上升，蛋白水平受影響，而其mRNA水平不受影響。結合文獻和本實驗數據表明，在糖尿病胰島中信號傳導軸從mTOR通路激活開始，通過mTOR激活GSK3β，PDX1降解。
圖2. db/db小鼠胰島中的關鍵信號通路被調節
03、挖掘致病關鍵信號軸
db/db胰島中PDX1（胰腺十二指腸同源框蛋白1）抑制使得GLUT2（葡萄糖轉運子）下調表達以及抑制β細胞糖酵解
研究發現在糖尿病組的胰島中GSK-3β 激活，導致PDX1降解，這也確定了PDX1在β細胞生理學中的重要性。那么在β細胞中PDX1下游靶標的表達是否同樣受到影響？結果顯示，與對照組相比，db/db胰島中所有PDX1的靶標都顯著下調表達，其中GLUT2蛋白下調表達程度最大(圖3A)。GLUT2作為一種葡萄糖感受器，能夠有效調節血糖濃度，密切參與葡萄糖誘導的胰島素分泌。
此外，糖尿病胰島中參與糖酵解和TCA循環途徑的關鍵酶顯著下調表達，該變化從整體上影響了葡萄糖代謝（圖3B）。此外，研究還發現幾乎所有呼吸酶的底物的表達水平均顯著下調，降低的糖酵解代謝導致ATP/ADP濃度比降低，進而可負反饋影響下游胰島素分泌機制。而對蛋白質組學數據的分析也表明許多參與胰島素細胞外分泌的蛋白顯著下調表達。
圖3. GLUT2抑制與糖酵解抑制相關
04、磷酸化組、蛋白質組在人胰島中驗證信號軸功能
糖毒性觸發GSK3依賴PDX1下調表達
在糖尿病過程中，不同的因素協同作用引起β細胞丟失和功能障礙。慢性或周期性暴露β細胞會導致葡萄糖和脂質或干擾β細胞功能促炎細胞因子水平提高。此外也有研究報道，GSK-3β可調控葡萄糖體內平衡。實驗結果也揭示了GSK-3β活化導致PDX1抑制，進而導致糖尿病胰島中胰島素分泌機制損傷。因此，作者進一步研究糖毒性是否可獨立觸發β細胞中GSK-3β激活，繼而導致PDX1轉錄因子及其下游靶標的降解。作者對三個不同志愿者胰島和INS1e大鼠β細胞分別給予高葡萄糖處理，隨后對其進行蛋白質組和磷酸化蛋白質組學分析（圖4A）。結果顯示，在響應慢性葡萄糖水平上升的過程中，一共約有7000個蛋白和19000磷酸化位點發生變化。
為了探討PI3K-AKT-GSK3以及其他關鍵信號通路激活狀態，通過組學數據以及結合文獻報道的信號通路。結果發現，在人胰島和大鼠β細胞中，慢性高血糖癥導致GSK3激活。同時還發現隨后GSK3的靶標磷酸化水平提高，PDX1 的Ser268磷酸化水平上升，導致其降解（圖4B）。PDX1靶標的表達水平，包括GLUT2和INS在db/db胰島中均下調表達（圖4C）。
后續作者進一步驗證GSK3在調控PDX1穩定性及其轉錄靶標GLUT2關鍵作用。首先，作者通過單獨或使用蛋白酶體抑制劑MG132, 通過抑制PI3K激活GSK3處理人胰島。結果發現，GSK3激活有效的導致PDX1降解和GLUT2抑制。更重要的是，GSK3激活的同時影響了葡萄糖誘導胰島素的分泌。那么抑制GSK3是否可改善糖尿病癥狀。作者通過使用GSK3抑制劑LY2090314處理肥胖小鼠，結果發現，該處理不僅恢復GLUT2和PDX1表達，同時完全恢復胰島分泌胰島素能力（圖4）。
圖4. 糖毒性誘導GSK3依賴PDX1下調表達
05、結論
作者通過基于質譜的高通量磷酸化蛋白組、蛋白質組學技術，結合生物信息分析，深入比較了正常和糖尿病小鼠胰島的磷酸化蛋白質組和蛋白質組信號網絡圖。 最終結果發現，GSK3是胰島素分泌的關鍵調節節點，抑制GSK3能恢復了糖尿病胰島分泌胰島素的能力。
小編總結
糖尿病是一類非常常見的代謝性疾病。雖然此前，關于糖尿病有大量組學報道的，包括利用轉錄組學以及蛋白質組學來研究不同2型糖尿病動物模型或人胰島，但是，這些研究主要是從參與β細胞損傷的差異基因或差異蛋白的角度進行分析，但大規模分析該疾病的磷酸化信號網絡變化的研究卻甚少。
正是利用了更為新穎的修飾組學進行研究，該文為我們呈現了一幅細致的糖尿病磷酸化網絡水平關鍵信號通路變化圖，并最終發現了胰島素分泌的關鍵調節信號軸。因此，對于一些利用轉錄組等常規組學做的較為深入的疾病而言。我們不妨從更為新穎的修飾組學入手，去挖掘一些新的疾病致病機制。