1. 標本
蓋片培養細胞匯合前從瓶中取出（如細胞已完全匯合，能影響對支原體的觀察）；
2. 漂洗
將細胞蓋片置于碟皿中，用不含酚紅的Hanks液漂洗；如為細胞懸液則先離心去上清營養液后，再加入Hanks液漂洗；
3. 固定
用醋酸甲醇（1：3）固定10 分鐘；
4. 漂洗
用生理鹽水或去離子水漂洗，處理方法同2；
5. 染色
置于33258（用不含酚紅的Hanks 或生理鹽水配制，濃度為50 μg/ml）中染色10 分鐘；
6. 漂洗
置于蒸餾水漂洗1～2 分鐘，處理方法同2；
7. 觀察
從蒸餾水中取出細胞蓋片，令細胞面向上，滴pH5.5 的磷酸緩沖液數滴，覆以24×36 mm2大蓋片，置熒光顯微鏡下觀察；如用細胞懸液則先離心，去上清蒸餾水，加3~5 滴上述磷酸緩沖液，稍吹打使沉淀細胞重懸浮，用吸管吸出，滴于載物片上，覆以蓋片后觀察。熒光顯微鏡下可見支原體呈亮綠色小點，散在細胞周圍，或附于細胞表面。
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