放射免疫分析法的建立1

一、放射免疫分析的基本試劑

（一）標準品

標準品是放射免疫分析法定量的依據，由于以標準品的量用來表示被涮物質的量，故標準品與被測物質應當化學結構一致并具有相同免疫活性。標準品作為定量的基準。應要求高度純化。標準品除含量應具有準確性外，還應具備穩定性，即在合理的貯存條件下保持原來的特性。

按實驗要求，將標準品用緩沖液配成含不同劑量的標準溶液，用于制作標準曲線。

（二）標記物

標記抗原應具備：①比放射性高，以保證方法的靈敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期盡可能長，標記一次可較長時間使用，這對來之不易的抗原尤其重要；④標記簡便、易防護。

要準確測量B與F的放射性，必須有足夠的放射性強度。所選用的標記抗原的量，在使用125I時達5000～15000cpm。

（三）抗體

應選擇特異性高、親和力強及滴度好的抗體，用于放射免疫測定。

根據稀釋曲線，選擇適當的稀釋度，一般以結合率為50%作為抗血清的稀釋度。

（四）B與F分離劑

以2%加膜活性炭溶液為例，2%加膜活性炭溶液的配制：

活性炭2g（杭州木材廠生產，森工牌732型）

右旋糖酐T200.2g

加0.1mol/L PB 至100ml

電磁攪拌1h，然后置于變通冰箱冰箱待用。

（五）緩沖液

放射免疫分析技術所用的緩沖液有多種，要通過實驗選用抗體和抗原結合最高的緩沖液。

目前最常用的緩沖液有下列幾種：①磷酸鹽緩沖液；②醋酸鹽緩沖液；③巴比妥緩沖液；④Tris –HCl緩沖液；⑤硼酸緩沖淮。其中以磷酸鹽緩沖液應用最多。

在緩沖液中，除必須有弱酸及弱酸的鹽成分外，還應根據不同檢測項目加入下列物質：

（１）保護蛋白：常用的有牛血清白蛋白或白明膠，濃度為0.1%～0.2%，用以降低試管對抗原的非特異性吸附。

（２）防腐劑：多采用0.1%疊氮鈉、0.01%柳硫汞、溶菌酶或抗菌素。

（３）酶抑制劑：如測定心鈉素等肽類激素時，要加入適量的抑肽酶，用以抑制血漿內源性水解酶對待測物的降解；又如測定cAMP、cGMP時，需加入 EDTA·2Na，抑制磷酸二酯酶的活性。
（４）阻斷劑：在測定甲狀腺激素或測定某些甾體激素時，必須加阻斷劑，使和蛋白質相結合的激素，變為游離型。常用的阻斷劑有8—苯胺—1—萘磺酸、柳硫汞、水楊酸鈉、三氯醋酸鈉等。

（５）載體蛋白：采用二抗作B與F分離劑時，要向反應液中加入適量與第一抗體同種動物的正常血清。在測定不含有血漿蛋白的樣品時，用PEG沉淀劑分離B、F，必須加適量γ球蛋白或正常人混合血清。

在神經肽的RIA時，常用PELH緩沖液，（按1000ml,pH7.6）：

0．1mol/l PB　　　　　　　　980.0ml

0.3mol/L EDTA·2Na　　　　　10.0ml

0.2%洗必泰溶液　　　　　　 10.0ml

溶菌酶　　　　　　　　　　　1.0g

二、加樣程序

由于抗原、標記抗原和抗體三者加樣次序不同，而出現兩種加樣程序，分述如下：

（一）平衡飽和加樣程序

1、基本原理所謂平衡飽和，是指抗原和抗體反應達到再不結合，也不解離的平衡狀態，稱為飽和狀態，即平衡飽和。所以，有人稱此為飽和分析法。這意味著抗原或被測抗原、標記抗原、抗體三者一起溫育。

2、加樣程序一般先加標準物或被測樣品，再加抗血清，最后加標記物。這樣的順序是讓標準物或被測物與抗體有短暫的結合，提高抗原的競爭抑制能力。在小分子半抗原的放射免疫分析中，標記抗原和未標記抗原與抗體結合的親合力常常是不相同的，前者比后者的親合力高。因此，上述加樣程序就更有必要，所以一般都采用先加標準物或樣品和抗血清，后加標記物。這樣測定也比較穩定。

在大分子蛋白質抗原的放射免疫分析中，如果是雙抗體分離法，抗原和標記抗原與抗體三者加樣，可不分先后，有的是標準物、標記物、抗血清的加樣順序，但一般習慣還是標準物或血樣、抗血清、標記物、然后混勻溫育24～48h，再加雙抗體，繼續溫育24h，使免疫反應達到平衡。對一些多肽激素的放射免疫分析，應用雙抗體分離法，其流程比較長，這樣的順序同樣可不分先后。

以大鼠垂體、下丘腦β-內啡肽RIA測定程序為例：

（１）加樣（單位μl；總反應體積500μl）

（２）孵育：4℃，24h