數字PCR簡介

1985年美國科學家Kary Mullis發明PCR方法以后，PCR已經成為生命科學研究領域中最常規的實驗方法之一。PCR是用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，可看作是生物體外的特殊DNA復制。PCR的最大特點，是能將微量DNA大量擴增。

最傳統的一代PCR采用瓊脂糖電泳的方式對PCR產物進行分析，操作繁瑣、難于做定量分析。為使PCR技術能對基因水平進行定量分析，1992年開發了熒光實時定量PCR（二代PCR）。實時定量PCR（qPCR）通常在DNA擴增時對反應體系中的熒光信號進行實時收集，通過三個參數間（熒光信號-Cq值（羅氏公司）或Ct值（ABI公司）-靶基因的起始濃度）的關系，能以相對定量的方式確定靶基因的拷貝數或推斷基因表達水平。由于熒光定量PCR的分析是相對定量的方式，這也是目前熒光定量PCR的最大技術缺點。在低拷貝靶分子、模板濃度差異的條件下，其檢測靈敏度、精確度都受到了限制。
1999年霍普金斯大學的Vogelstein教授首先提出了第三代的Digital PCR（數字PCR）的概念。此后數字PCR技術得到迅速的發展。數字PCR是一種核酸檢測和絕對定量的新方法。同傳統PCR相比，數字PCR增加了一步分隔(partitioning)的操作，將幾十微升的反應體系分隔成了眾多微小獨立反應體系。核酸模板在這種分割過程中被充分稀釋，理想狀態下每個微反應體系中至多含有1個分子的核酸模板。和qPCR不同，數字PCR不對擴增過程進行實時監測，而是檢測end-point的熒光信號。擴增完成后所有液滴的熒光將逐個被識別并進行計數，不需要構建標準曲線，就可以得到絕對定量的結果。
目前數字PCR的主要產品有：
1. QX200

 QX200目前已經是Bio-Rad的產品。Bio-Rad的技術主要來源于QuantaLife公  司，QuantaLife 利用油包水微滴生成技術開發了微滴式數字ddPCR，這是最早出現的相對成熟的數字PCR平臺，在運行成本和實驗結果穩定性方面都基本達到了商品化的標準。 2011年QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收購，其微滴式數字PCR儀產品更名為QX100，繼續在市場上銷售，2013年該公司又推出了升級型號QX200。
2. Raindrop

Raindrop數字PCR是美國RainDance Technologies公司于2012年推出的產品。能夠提供更高的檢測范圍，適用于處理更大濃度差異的不同樣品，這個設備將其原有的二代測序文庫制備平臺技術也整合進入數字PCR技術平臺，在高壓氣體驅動下，將每個標準反應體系分割成100萬至1000萬個P升級微滴反應乳液，這種超高的微滴數目可以為用戶“提供更高的檢測動態范圍，適用于處理更大濃度差異的不同樣品。在2017年Bio-Rad完成了對RainDance公司的收購。
3. Quant Studio 3D

Applied Biosystems 公司2013年也推出了Quant Studio 3D數字PCR系統，是目前數字PCR市場上新型號產品之一。采用高密度流控芯片技術，使樣本均勻分配至20,000個單獨的反應孔中。在整個測定流程中，樣本之間保持完全隔離，防止樣品交叉污染。移液過程和操作步驟減少。芯片式設計避免了微滴式系統可能出現的管路堵塞問題。Applied Biosystems在OpenArray芯片平臺之外推出的全新的芯片式數字PCR系統，這個全新系統在設計上綜合考慮了系統穩定性與運行成本因素。 2013年Thermo Fisher公司收購了Applied Biosystems。 
Quant Studio 3D 數字PCR可用于分子標準品定量；原體檢測和定量測定；罕見癌癥基因突變檢測；拷貝數變異分析；GMO檢測和污染評估；mRNA 和miRNA表達低倍變化的確定等。
4. Naica TM crystal

Naica? crystal數字PCR系統是由法國Stilla Technologies公司推出的產品。將微滴均勻性和芯片可視化以及相同PCR反應條件創新性集成在同一系統中，使用微流體創新型Sapphire芯片，樣品通過毛細通道網格以30,000個Crystal微滴的形式進入發布在2D芯片中。 這種方法在滿足實驗室對數據精準性、重復性要求的同時，讓數字PCR分子檢測變得更加簡單快捷。PCR擴增過程在芯片上實現。最終對陽性微滴計數從而得到精準的核酸絕對數量。作為首款三個熒光通道檢測的數字PCR平臺，Naica? crystal數字PCR系統可在2小時內實現多達36個目標基因的檢測。Naica? Crystal系統由Geode微滴生成；擴增儀和Prism3微滴閱讀分析系統組成，僅需唯一耗材——Sapphire芯片，即可完成從加樣、微滴生成和擴增，直到采集數據獲得結果。　r> Naica? crystal數字PCR可用于：基因表達差異檢測；拷貝數變異(CNV)；低豐度及稀有序列的精確定量；甲基化含量鑒定；腫瘤治療的伴隨診斷；無創產前篩查；病原微生物的檢測(病毒、細菌等)；二代測序輔助建庫；腫瘤治療的實時監控 (ctDNA檢測)等。