數據分析介紹(II)Cytoscape

本期為大家介紹一個開放源碼的生物資訊軟件 –Cytoscape，它可以建構可視化的分子交互作用網絡，并可將已有的基因表達信息(gene expression profiles) 整合進此網絡中，輕易觀察分子間 (蛋白質—蛋白質 或 蛋白質—DNA…) 的關聯性。

Cytoscape 是 Institute for Systems Biology (Leroy Hood 實驗室)、加州大學圣地亞哥分校 (Trey Ideker 實驗室)、加州大學舊金山分校 (Bruce Conklin 實驗室)、Memorial_Sloan-Kettering 癌癥研究中心 (Chris Sander 實驗室)、Pasteur 研究院 (Benno Schwikowski 實驗室) 等研究單位共同合作開發的一個開放源碼的生物信息分析軟件。Cytoscape 的核心即是網絡 (圖一)，每個節點 (node) 是基因、蛋白質或分子，而節點與節點之間的連接 (edge) 則代表著這些生物分子之間的相互作用 (圖二)。

使用 Cytoscape 案例

我們先舉一些有使用 Cytoscape 的文獻作為例子，讓大家知道它所帶來的意義為何。Jie Wang¹ 等人利用華聯的 HOA 和 HmiOA 芯片產品，于今年發表了一篇文章，研究是否可以從 mRNA 和 miRNA 基因表現整合的網絡調控關系中找出影響疾病 (有 BSS 癥狀的心絞痛病人) 可能的關鍵因子(biomarker)；實驗結果發現 23 個 miRNA 被正向調控 (up-regulated) 以及 408 個基因被負向調控，作者將這些資料全部丟進在線分析網站miRTrail (Laczny² 等人于 2012 年發表整合 mRNA 和 miRNA 芯片表現分析工具) 進行分析, 利用內建的 microCosm 預測 miRNA 對應的標的基因 (target genes) 并和 408 基因做交叉比對，發現交集的基因總共有115個；并依據預測標的基因和 408 基因交叉比對且符合負向調控程度較高的基因群，作優先選擇的 miRNA 標的(前百分之五)，從 23 個 miRNA 中挑出了 6 個(miR-146b-5p, miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-326, miR-423-3p and miR-484)。最后將找到的 115 基因和 6 個 miRNA 繪制成 network (圖三)，我們就可以清楚觀察這 6 個 miRNA 和經過芯片實驗驗證的基因之間調控的關系，找出交互作用頻率高的基因_(尺寸較大的圓圈)。作者最后挑選了miR-146b-5p、miR-199a-5p 以及 TP53、CALR 基因，另外找了一群病人 (包含控制組 15 人、BBS 癥狀的心絞痛疾病 30 人以及非 BSS 癥狀的心絞痛疾病 30 人)做 RT-PCR 驗證，也得到一致的結果，可以當成醫生治療這類病人的重要生物指標。

另外，蛋白質之間的調控作用本來就是 Cytoscape 的分析強項，所以為了觀察 115 負向調控基因對應的蛋白質之間的交互作用(PPI，Protein-Protein Interaction)，作者將 Reactome FI 這個配件 plug-in 于 Cytoscape 中，將對應的蛋白質交互作用，以圖形方式呈現(圖四)，也提供后續蛋白質研究做一個參考。

除了利用顏色觀察表現量的變化，也可以用來表示其他量化的連續性數據；2012 年 Pahl ³ 等人的研究中利用 TargetScan、MirTarget2 以及 Pictar 提供的數據庫預測實驗有顯著表現差異miRNA 所對應的標的基因，并使用 Cytoscape表現之間的相關性(圖五)。這些預測的標的基因和 miRNA 也被放入 RNAhybrid version 2.1 程序中仿真計算 mRNA-miRNA 之間雜交的minimum free energy (△G，kcal/mole)，藉此評估 mRNA-miRNA 之間鍵結的強度。前提是計算 minimum free energy 必須于 Ensembl Biomart 取得標的基因的 3’UTR 序列，若沒有對應的序列數據將無法計算，圖中會以黑線和黑色圈圈表示。從圖中的四個 miRNA network 中，可以得知 miR-331-3p 擁有最低的 minimum free energy，表示此 miRNA 和對應的標的基因之間有較強的親和性；miR-133a 和 miR-133b 因為序列相似所以對應到大部分重復的標的基因，但由于兩者之間差了兩個 base pair，導致和基因之間的親和性不同。作者也進一步找出圖中可能的潛在標的基因，例如：CSRNP1、SLC7AB、PLK3、FURIN 同時是 miR-133a、miR-133b、miR-331-3p 的預測 target genes；DNM2、DNAJB1、TGFBR1、TGOLN2、BCL11A、EDEM1、SFXN2、YTHDF3 八個基因同時是miR-204、miR-133a、miR-133b 的預測標的基因， 而Hypermethy- lated_in cancer 2 (HIC2) gene 則是唯一被四個 miRNA 同時所預測的標的基因；它屬于 HIC1 家族基因，極可能是重要的腫瘤抑制基因。

如何使用 Cytoscape

要完成一個 Cytoscape 的網絡分析，基本上有 4 個步驟：(搭配影片教學，事半功倍!)

1. Create a network

2. Import a attribute / expression profile

3. Filtering & editing

4. Annotation & data analysis

步驟 1，要先有一個網絡，可以是從已知的數據庫中取得某個特定的網絡，例如有 TP53 參與的基因網絡、Apoptosis pathway 基因網絡…，或可自行建立，而后續的動作則會架構在此網絡上進行分析；步驟 2，加載想要分析的屬性數據，亦或是使用華聯芯片服務得到的 gene expression profile (fold change、p-value…)；步驟 3，由于加載的數據往往是很龐大的，要利用篩選、編輯，變成想要的信息；步驟 4，最后可利用此結果再進行后續的批注或分析。

小結

Cytoscape 源自系統生物學，用于將生物分子交互網絡與高通量基因表達數據和其他的分子狀態信息整合在一起。其最強大的功能在于大規模蛋白質與蛋白質相互作用、蛋白質-DNA或遺傳分子交互作用的分析。Cytoscape 是開放源碼的軟件，任何人都可依自己的需求作修改，或是 Plug-in 后，修改成自己想要的形式，若有厲害的程序開發高手，亦可快速建構出新的功能。各位在使用上若有任何問題，都歡迎與我們討論。

另外，帶來一個好消息：華聯 2013 最新力作，累積 6 年服務經驗深蘊，整合推出 30 項生物信息分析服務 - BiXOneArray，帶給大家從初階到進階的全方位分析服務 !

參考資料

(1) Jie Wang et. al. A Systems Biology Approach to Characterize Biomarkers for Blood Stasis Syndrome of Unstable Angina Patients by Integrating MicroRNA and Messenger RNA Expression Profiling. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine (2013) March 29

(2) Laczny C et. al. miRTrail - a comprehensive webserver for analyzing gene and miRNA patterns to enhance the understanding of regulatory mechanisms in diseases. BMC Bioinformatics (2012) 13:36

(3) Matthew C Pahl et. al. MicroRNA expression signature in human abdominal aortic aneurysms. BMC Medical Genomics (2012) 5:25