敲降斑馬魚基因的方法學比較

一、基因敲降的前期準備工作相同
1.1 生物信息學分析目標基因在斑馬魚早期胚胎發送過程中是否有表達。
1.2 收集斑馬魚早期發育胚胎（通常為48 hpf前的胚胎），提取總RNA，然后進行體外轉錄（RT）。
1.3 設計檢測目標基因表達的PCR引物，以1.2獲得的cDNA為模板，進行PCR擴增，確認目標基因在早期有表達。
 
二、MO法與CRISPRi法的敲降原理不同
2.1 MO是在轉錄后水平上敲降基因的功能（MO-Spl阻遏原始轉錄本的剪接，MO-Atg阻遏成熟轉錄本的翻譯）（基因轉錄后調控）
2.2 CRISPRi 是在轉錄水平上敲降基因的功能（抑制基因的轉錄）(基因轉錄水平的調控）。
 

• 敲降工具有效性驗證的方法不同

3.1 嗎啡啉敲降法（確認有效性）的技術路線
抑制翻譯的MO（MO-Atg）和抑制剪接的MO（MO-Spl）二者敲降基因的有效性評價方法不同。抑制剪接的MO（MO-Spl）的有效性評價方法是通過RT-PCR直接檢測原始mRNA轉錄本的正常剪接是否被改變；抑制翻譯的MO（MO-Atg）的有效性評價通常需要通過蛋白質印跡法進行檢測。但是，由于適用于斑馬魚的抗體很少，過去一般通過報告基因法來進行有效性評價（參見我們發表的論文Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055 )，但后來斑馬魚領域給出的MO使用指南（見已發表的研究論文：Stainier et al., 2017. Plos Genetics, 13(10): e1007000）指出這種報告基因評價法缺乏特異性，因而不再推薦該報告基因評價方法。也正是由于沒有相應比較方便的評價方法，一般不推薦此種抑制翻譯（MO-Atg）的MO敲降法。確認抑制剪接的MO（MO-Spl）敲降基因有效性的技術路線如下：
3.1.1 分析斑馬魚目標基因的基因組組成（外顯子-內含子結構），然后針對該基因，設計阻遏原始轉錄本剪接的嗎啡啉（morpholino）（MO-Spl）。
注：MO-spl不能阻止母源轉錄本的翻譯，如果要阻止母源轉錄本的翻譯，需要設計阻遏原始轉錄本翻譯的嗎啡啉（MO-Atg）。
3.1.2 訂購嗎啡啉MO-Spl或MO-Atg和標準對照MO。
3.1.3 將不同濃度的MO-Spl注射入斑馬魚受精卵（標準對照MO僅注射最高濃度）
3.1.4 待注射胚胎發育至特定時期（優選48 hpf前的某些時期），收集胚胎，提取總RNA，然后進行體外轉錄（RT）。
3.1.5 按1.3已建立的方法進行RT-PCR擴增，確認目標基因的原始轉錄本的正常剪接是否被阻遏（發生異常剪接）。同時，設置檢測管家基因表達作為內參對照，確認整個RT-PCR過程正常。
注：如果是使用MO-Atg，則無簡單易行的有效性檢測方法（一般不做有效性檢測，僅開展特異性檢測）。
3.1.6 分析3.1.5的實驗結果，確定MO敲降工具的有效性，以及實現有效敲降的最低注射濃度。
 
3.2 CRISPRi敲降法（確認有效性）的技術路線
CRISPRi敲降的有效性可以通過RT-PCR法檢測目標基因表達水平是否被有效下調來進行直接評價。一般使用普通半定量RT-PCR即可，確有需要，可以考慮定量RT-PCR法確認敲降程度。
3.2.1 分析目標基因的基因組結構，確定目標基因轉錄起始位點和/或5’UTR位置。 根據目標基因的轉錄起始位點的特征，設計sgRNA識別位點---CRISRP序列的設計（不少于4個）。
3.2.2 體外合成至少4條不同的sgRNA（每基因）和 dCas9-Eve mRNA。
3.2.3 將4條sgRNA按不同濃度和dCas9-Eve mRNA混合后共同注射斑馬魚受精卵。同時以相同濃度的dCas9-Eve mRNA注射受精卵作為空白對照。
3.2.4 待注射胚胎發育至特定時期（優選48 hpf前的某些時期），收集胚胎，提取總RNA，然后進行體外轉錄（RT）。
3.2.5 按1.3已建立的方法進行PCR擴增，確認目標基因的表達水平是否被有效抑制（阻遏轉錄）。同時，設置檢測管家基因表達作為內參對照，確認整個RT-PCR過程正常。
3.1.6 分析3.2.5的實驗結果，確定CRISPRi敲降工具的有效性，以及實現有效敲降的最低注射濃度。
 
四、CRISPRi敲降方法的特異性優于MO法的特異性
基因敲降方法的特異性需要通過表型拯救的方法來回答。之所以需要表型拯救，是因為需要排除基因敲降的表型是由于敲降工具的脫靶或者敲降試劑本身的毒性而導致的非特異表型，換句話說，要排除敲降表型是源于基因敲降工具的脫靶或者試劑本身的毒性所造成的這種可能。
拯救的基本實驗策略是：在基因敲降的基礎上，過表達被敲降的基因（通常是同時顯微注射目標基因的戴帽mRNA），然后觀測原來出現的表型是否被恢復（或有所恢復）至正常（參見我們發表的論文Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055 )。如果基因敲降的表型在過表達目標基因的mRNA后有很好的拯救，那么可以確認敲降方法是特異的。
基于基因組編輯技術的CRISPRi敲降方法，一般同時注射4個sgRNA + dCas9-Eve mRNA。先前的很多研究已經發現，單個sgRNA引導dCas9-Eve所發揮的抑制基因表達的功能遠沒有多個sgRNA同時引導dCas9-Eve發揮的抑制功能強（參見我們發表的論文Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055 )，這種多個sgRNA的協同作用決定了CRISPRi法脫靶作用可以忽略，而RNA本身的毒副作用是完全可以進行對照的（使用一組僅注射dCas9-Eve mRNA作為對照）。
相對而言，MO的脫靶效應要大很多。事實上，有實驗證據表明：即使有多達5 bp的錯配，MO也會發生作用。而對于一個25 nt長的MO而言，5 bp錯配在基因組中的類似序列可以是成白上千。因此，MO敲降的脫靶機會很大。
另外，有研究報道注射MO可異常激活斑馬魚p53基因的表達，非特異性地誘導胚胎細胞凋亡，因此，在很多情況下，如果使用MO作基因敲降，是需要同時注射敲降p53基因的MO以抑制過表達的p53（請參考已發表的文獻Robu et al., 2007. PLoS Genet. 3(5):e78）。
窗體底端
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再者，如果MO自身就存在毒性（源于序列本身或者化學合成過程），則是無法進行對照的。MO方法剛發明不久，就有研究指出即使是同一種序列，不同批次合成的產品的毒性也可能是不一樣的，顯然，這種“內在”的毒性是無法進行對照的。
 
五、CRISPRi敲降工具（RNA形式）供貨周期遠短于MO敲降工具
由于MO工具需要在美國合成，受進口手續、海關通關等的影響，到貨時間一般不少于30個工作日。而CRISPRi敲降工具（RNA形式）完全有本公司自主生產（已申請國家發明ZL，ZL申請號：201610843834.8），不超過20個工作日（一般為10個工作日）即可制作好，干冰寄送（到貨）。
 
六、CRISPRi敲降工具（RNA形式）的費用低于MO法的敲降工具（人民幣元）

 
七、優先推薦CRISPRi法敲降斑馬魚基因
一般來說，一個基因的敲降方法如果尚未見報道的話，僅以一個MO敲降的話，未來發表論文時，審稿人一般會要求需要再有一個獨立敲降的方法重復前一個MO的實驗結果。其原因也非常簡單，因為基因是否被成功敲降是研究基因缺失功能的前提。只有確認基因本身被成功特異敲降，才能開始后續的功能研究（表型分析）。在不確定敲降方法是否有效且特異的情況下，所有獲得的結果毫無疑問都是值得存疑的。
因此，我們推薦使用CRISPRi + MO 法同時進行敲降同一個基因（參見我們發表的論文Dong et al., 2017. J Biol Chem. 292(31):13045-13055）。在使用兩種獨立的、原理完全不同的敲降方法后，如果得到的敲降效果（表型）是一樣的，那么這樣建立的基因敲降方法毫無疑問可以被認可是有效且特異的。
如果一定只想先選用一種基因敲降方法篩選初步評價基因缺失功能，我們優先推薦CRISPRi法，理由如前述（有效性高、脫靶機會小、毒副作用小、供貨周期短、價格便宜）。