斑點酶聯免疫吸附測定

實驗概要

斑點酶聯免疫吸附測定法(DotELISA，DELISA)是以纖維素膜代替免疫酶固相載體法中常用的聚苯乙烯微量反應板而建立的一種免疫檢驗方法。DELISA不僅保留了常規ELISA的優點，而且還彌補了抗原或抗體對載體包被不牢等不足，所以具有敏感性高，特異性強，被檢樣品用量少，節省材料，不需特殊儀器，結果判定簡單易行和便于長期保存等特點。因此，該法自問世以來，以其獨特的優勢，廣泛應用于抗原抗體的檢測和雜交瘤細胞的篩選等。

實驗原理

DELISA的基本原理與常規ELISA和免疫酶染色法基本相同，即將抗原或抗體首先吸附在纖維素薄膜(如硝酸纖維素膜，NC)表面，并保持其免疫活性，通過與相應的抗體或抗原和酶標記物的一系列免疫反應，形成酶標記抗原抗體復合物，在底物的參與下，結合物上的酶催化底物使其水解、氧化成另一種帶色物質，沉著于抗原抗體復合物吸附的部位，呈現出肉眼可見的顏色斑點。試驗的結果可通過顏色斑點的出現與否和色澤深度進行判定。DELISA常用的檢測方法有直接法、間接法、雙抗體夾心法、雙夾心法和競爭法等。

主要試劑

1. 載體：硝酸纖維素膜0.22～0.45μm，Schleiche & Schucll或國產；混合硝酸纖維素膜0.22μm。

2. 保溫液及洗滌液：保溫液為含0.1%BSA、0.05%Tween20 PBS(0.01mol/L，pH值7.4)；洗滌液為0.05%Tween20 PBS。

3. 封閉劑：含1%BSA或4%蛋清或3%白明膠的PBS。

4. 口蹄疫單抗：口蹄疫病毒A型單克隆抗體(AFMcAb)、O型多克隆抗體(OFPcAb，由O型標準病毒免疫BALB/c鼠制得)。

5. A、O、C、ZB型口蹄疫標準抗原。

6. 凍干辣根過氧化物酶標記兔抗BALB/c鼠抗體。

7. 底物溶液：3，3二氨基聯苯胺50mg，0.05mol/L、pH值7.6 TrisHCl 緩沖液100ml，溶解后過濾，4℃避光保存。臨用前按0.03%加入H₂O₂。

8. 被檢抗原的制備：水皰液可直接點樣。水皰皮用生理鹽水洗凈，晾干，稱重，剪碎，加中性玻璃砂研磨，用生理鹽水制成1∶5～1∶10懸液，室溫浸泡2h，振搖后，1 500～2 000 r/min離心10min，上清液即可用于點樣。

實驗步驟

DELISA間接法程序

1. 壓跡：根據樣品的數量剪取一片硝酸纖維素膜或混合纖維素膜。用直徑3～5mm圓形打孔器(瓊脂平板打孔器)，在膜的光滑面按順序壓上痕跡，作為點樣部位。將膜置蒸餾水中浸泡，待完全浸濕后，取出室溫自然干燥。

2. 點樣：用微量移液器分別吸取1～2μl(或用玻璃棒、毛細管蘸一滴)被檢抗原液，滴于圓圈內，自然干燥。為增加抗原吸附量，也可在點樣干燥后，再進行第二次點樣。同時作陰、陽性抗原對照。

3. 封閉：將膜置平皿或小池內，加入封閉劑，37℃浸泡30～60min。取出稍置片刻，用洗液漂洗2次，晾干。

4. 與AFMcAb或OFPcAb反應：用保溫液對AFMcAb或OFPcAb作適當稀釋，加入反應池中，于37℃覆蓋膜2h。

5. 洗滌：用洗滌液漂洗膜3次，每次3min，晾干。

6. 與酶結合物反應：凍干辣根過氧化物酶標記兔抗BALB/c鼠抗體用保溫液作1∶80稀釋，37℃覆蓋膜1h。

7. 洗滌：3次，方法同上。

8. 顯色：將膜浸入底物溶液中，避光染色5～15min。

9. 終止反應：用蒸餾水漂洗濾膜，晾干。

10. 結果判定

在陰、陽對照正常情況下，以在膜圓圈內出現棕色斑點為陽性，無色為陰性。膜干燥后，可長期保存。

在應用DELISA間接法、雙抗體夾心法等檢測方法時，如果膜上包被的是已知的標準抗原或抗體，而不是被檢樣品，為了操作方便，可將上述的“診斷膜”按壓跡剪成小片，置微量反應板的小孔中。在微孔中，“診斷膜”與相應的被檢樣品和診斷液發生一系列的抗原抗體反應和酶促反應。在試驗中，被檢樣品和診斷液的用量均為每孔50μl，其他反應條件和操作法與常規ELISA相同。

注意事項

1. 點樣量不易過大，以免溢出壓跡圈外，造成各樣品混合，如要增加樣品吸附量，可在一次點樣干燥后，再進行第2次點樣。

2. 膜包被后，一定要封閉確實，防止抗原或抗體的非特異性吸附，避免膜本底染色過深。

3. 結果判定時，應與陰、陽性對照斑點反復比較，盡量克服肉眼觀察所帶來的誤差。