與常規的微量板ELISA比較，Dot-ELISA具有簡便、節省抗原等優點，而且結果可長期保存；但其也有不足，主要是在結果判定上比較主觀，特異性不夠高等。該方法的主要操作程序為：
⑴載體膜的預處理及抗原包被 取硝酸纖維素膜用蒸餾水浸泡后，稍加干燥進行壓圈。將陰性、陽性抗原及被檢測抗原適度稀釋后加入圈中，置37℃使硝酸纖維素膜徹底干燥。每張7cm×2.3cm的膜一般可點加40－53個樣品，每個壓圈可加抗原液1－20μl。
⑵ 封閉 將硝酸纖維素膜置于封閉液中，37℃感作15－30分鐘。封閉液多采用含有正常動物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。
⑶ 加被檢血清 可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量適度稀釋的待檢血清，37℃反應一定時間，用洗滌液洗三次，每次1－3分鐘。洗滌液一般為一定濃度的PBS-Tween溶液。
⑷ 加酶標抗體，37℃反應一定時間后，用洗滌液洗三次。
⑸顯色 加入新鮮配制的底物液，37℃反應一定時間后，去掉底物液，加蒸餾水洗滌終止反應。
⑹ 結果判定 以陽性、陰險血清作為對照，膜片中央出現深棕紅色斑點者為陽性反應，否則為陰性反應。