| 實驗步驟 | 鱒魚胚胎提取物：
(a)收集胚胎（受精后 28 天的 Shasta Rainbow 或其他鱒魚種系，在 10°C 條件下飼養，或者受精后 3 天的斑馬魚，在 28°C 條件下飼養），在 -80°C 條件下凍存
(b)為了制備提取物，將約 150 g 胚胎融化后，采用 Tissuemizer 勻漿器（Tekmar ) 用 10 ml LDF 在冰上勻漿 2 min
(c)將勻漿通過數層紗布過濾后去除絨毛膜，然后在 4°C 條件下離心（20000 g，30 min )
(d)離心后收集上清液，留下表面的亮橘色脂層
(e)將上清液移入 1 只新離心管，按操作步驟（c ) 離心
(f)收集上清液，留下剩余的脂質，然后在 4°C 條件下超速離心（100000 g，60 min )
(g)超速離心后收集上清液，留下脂層。用 LDF (1 : 10 ) 稀釋上清液，然后過濾除菌
(h)提取物過一系列濾器（1.2 μm、0.45 μm和 0.2 μm )過濾
(i)將提取物按 0.5 ml 分裝后，在 -80°C 條件下凍存
(j)為了用提取物培養細胞，測量蛋白質濃度（見方案 21.4 )，然后用 LDF 將提取物稀釋至理想的工作濃度
(k)將稀釋的提取物在 4°C 條件下冷藏，最長 2 個月
BRL 細胞條件培養液：
(a)在 37°C 條件下和在 75 cm2 培養瓶中，用 DMEM/F12/10FB 培養液培養 BRL 細胞（ATCC )
(b)當細胞匯合時，用添加 2% FBS 的 LDF 置換 FD 培養液，在 37°C 條件下培養
(c)5 天后吸出 LDF，過濾，在 -20°C 凍存
(d)向細胞中加入新鮮的 LDF，5 天后重復此過程。條件化的 LDF 培養液可從同一個培養瓶中收集 3 次。然后，將細胞分開培養，使細胞再次匯合
1. 用 LDF 維持培養液培養從早期斑馬魚胚胎獲得的細胞如 ZEM-2，至約 70% 匯合。
2. 在 26°C 和環繞空氣的條件下培養細胞。
3. 約每 5 天換培養液1 次。
4. 經胰蛋白酶消化，繼代培養（見方案13.2 )。
已表明鱒魚血清和胚胎提取物剌激其他魚類胚細胞的生長 [ Cdlodi and Bames,1990 ] 。 展開 |
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