4、二聚體
設計時通常將二聚體（自身二聚體或配對二聚體）控制在dG>-5.0kc/m, 最好dG>-3.6 kc/m。從圖8顯示的三套引物探針的自身二聚體可見，第二套的探針具有一個非常穩定的自身二聚體（dG=-13.1kc/m），第二套的上游引物N2F有一個穩定的自身二聚體（dG=-9.3kc/m），第三套下游引物具有一個比較穩定的自身二聚體（dG=-7.0kc/m）。
圖9顯示，美國CDC的第二套引物探針具有比較穩定的配對二聚體（dG=-9.0kc/m）。圖10顯示第三套有兩個比較穩定的配對二聚體（dG=-10.1kc/m）。
圖8：美國CDC基因引物和探針的自身二聚體
圖9：美國CDC第二套引物探針的配對二聚體
圖10：USCDC第三套引物探針配對二聚體
此外，當采用一管多檢（多重PCR）時，即一管同時檢測多個位點或多種病菌時，還要考慮不同位點之間的引物探針的配對二聚體。例如第一套和第二套組合時（圖11），第一套的正向引物和第二套的探針有一個相對穩定的配對二聚體（dG=-8.3kc/m）。第一套和第三套組合時（圖12），第一套的探針和第三套的正向引物有一個穩定的二聚體（dG=-12.2kc/m）。第二套和第三套組合時，第二套的上游引物和第三套的上、下游引物各有一個比較穩定的二聚體（dG=-7.0kc/m圖13）。
圖11：美國CDC N基因第一套和第二套配對二聚體
圖12：美國CDC N基因第一套和第三套配對二聚體
圖13：美國CDC N基因第二套和第三套配對二聚體
綜上所述，美國CDC設計的三套引物探針，位置的選擇及Tm值的設計均比較合理，但是二級結構比較穩定。第一套的反向引物N1R存在一個非常穩定的發夾（dG=-2.3kc/m，圖7）。第二套探針的自身二聚體非常穩定（dG=-13.1kc/m，圖8），上游引物自身二聚體也比較穩定（dG=-9.3kc/m，，圖8），比較穩定的配對二聚體比較多（dG=-6.8 ～ 9.0kc/m,圖9），引物和探針的利用效率會比較低。第三套探針N3P具有一個相對穩定的發夾（dG=-1.3kc/m，圖7），探針和引物值均有相對穩定的配對二聚體（圖10）。
四、結果的判斷
美國CDC提出對結果的判斷意見，認為只有當三個位點同時擴增曲線超過域值才能判斷為陽性（如圖11）。
筆者認為這種判別是沒有理論依據的。Taqman探針法熒光PCR除一對特異的引物以外還有一條特異的探針，基于設計的非特異性擴增的理論概率是非常小的。在新型冠狀病毒檢測中，以美國CDC的第一套引物探針為例，從圖1可見，上游引物處SARS病毒有一個3-bp的插入，是不可能擴增的，蝙蝠病毒在上游引物有4個突變，探針有1個突變，下游引物有5個突變，理論上由于錯配檢測出最接近的蝙蝠序列（假陽性）的概率為(1/4)10=9.5367x10-7。如果出現假陽性，最大可能性是交叉污染或氣溶膠污染。正確的判斷應該是，上述三個位點至少一個位點的擴增曲線超過了域值，即可判斷病例為陽性。目前市場上常見的熒光PCR檢測試劑大多數也只使用一個位點。
五、結論和建議
引物探針的設計原則中，最重要的是要避免假陰性（漏檢），同時保證特異性（避免假陽性），所以要選擇組內（需要檢出的序列）保守（即盡量避開突變或采用簡并序列）、組間（對照序列）特異的區域，同時盡可能提高反應中引物和探針的利用效率。筆者認為參數的重要性依次是引物探針的位置、探針的發夾結構、探針對上游引物的相對位置、Tm值、引物發夾、二聚體。
筆者對WHO發表的來自七個國家設計的引物探針進行了詳細分析，發現均存在一定的缺陷，有些缺陷比較明顯，主要體現在：
1） 不特異（德國的E基因、香港大學Orf1b基因）；
2） 探針的發夾結構穩定（中國CDC Orf1ab基因的探針、德國的SARS RdRP基因探針P1、香港大學N基因的探針）；
3） 引物和探針的相對位置不合理（中國CDC的N基因、德國的E基因、香港大學的Orf1b基因及E基因（設計在反鏈上）、日本的N基因）；
4） Tm值不合理（中國CDC的N基因及Orf1ab基因、德國的SARS RdRP基因及E基因、香港大學的Orf1b基因及N基因、日本的N基因、泰國的N基因）；
5） 引物的發夾結構穩定（美國CDC N基因第一套的反向引物、香港大學Orf1b基因的正向及反向引物、香港大學N基因的正向引物）；
6） 引物探針的自身二聚體穩定（中國CDC Orf1ab基因反向引物、美國CDC的N基因第二套的探針N2P、德國的E基因探針P1、香港大學的N基因正向引物及探針）；
7） 引物探針的配對二聚體穩定（中國CDC的N基因、美國N基因第二和第三套、德國的E基因）。
筆者認為存在穩定的發夾結構的探針基本不可以用。探針離上游引物太遠的擴增效率低，很難通過優化來提高效率，應該盡可能避免。其他二級結構可能通過添加PCR促進劑或加入過量的組分（引物探針、Taq酶等）得到改善，Tm值不理想可以通過調整退火和延伸的溫度，但是象以上一些設計的引物和探針Tm值幾乎一樣，是不合理的，應該避免。
實際上，新型冠狀病毒的基因組與最接近的蝙蝠冠狀病毒的差異達到4%，與SARS病毒的差異達到20%，而目前的數據顯示武漢新型冠狀病毒內部的差異非常小，約為十萬分之三（3.3x10-5），在基因組中或在N基因及Orf1ab基因中均有很多區域可以設計特異的、高效率的引物探針用于熒光PCR檢測試劑的開發應用。
磨刀不誤砍柴工，在科學技術面前沒有真正的捷徑可走。科學地設計引物探針是開發熒光PCR檢測試劑的基礎，是保證試劑盒靈敏度及特異性最基本的要素。為了避免走彎路，浪費資源，建議行業內的廠家，嚴格按照熒光PCR技術引物探針設計的原則開發新型冠狀病毒熒光PCR檢測試劑。