1、引物探針的位置
引物探針的設計原則中，最重要的是要避免假陰性（漏檢），同時保證特異性（避免假陽性），所以要選擇組內（需要檢出的序列）保守（即盡量避開突變或采用簡并序列）、組間（對照序列）特異的區域。此外，為了獲得最佳的擴增效果，還應盡量滿足表1中的基本要求。
用SARS和蝙蝠CoV的N基因序列作為對照，對新型冠狀病毒的N基因序列排序，從圖1、2、3中可見，在美國CDC的設計中，除了第二套的上游引物不特異外，其余探針和引物的位置都是選擇了組內保守組間特異的區域。第二套的探針和下游引物都是在特異的區域，所以也不會產生非特異的擴增。
圖1：美國CDC 2019-nCoV 第一套引物探針位置
圖2：美國CDC 2019-nCoV 第二套引物探針位置
圖3：美國CDC 2019-nCoV 第三套引物探針位置
第三套設計的探針N3P對2019-nCoV不特異（可同時結合到蝙蝠CoV）,5’端第二個位置設置為Y即T/C簡并，恰恰不能區分新型冠狀病毒、蝙蝠冠狀病毒和SARS病毒。但是上下游引物均為2019-nCoV特異，可能不會產生非特異性（假陽性）擴增。
2、Tm值
Taqman探針法熒光PCR通常采用二步法，即在94℃左右變性，60℃退火和延伸。所以，通常引物的Tm值設計在60±2℃，探針在70±2℃。
圖4: 美國第一套設計的Tm值
圖5：USCDC N基因第二套Tm值
圖6a: USCDC N基因第三套Tm值，探針5’端第二個序列為C
圖6b: USCDC N基因第三套Tm值，探針5’端第二個序列為T
從圖4、5、6中可見，這三套設計中的Tm值基本符合表1中的要求。第三套的探針N3P 5’端第二個序列設計為Y（T/C簡并），此處為C時（圖6a），探針N3P的Tm值略高，但通過優化應該不會成為主要問題。
3、引物和探針的發夾結構
穩定的二級結構（二聚體或發夾）降低引物探針利用效率的重要因素，特別是探針的發夾，容易造成探針利用率降低，從而使熒光信號偏低，影響檢測靈敏度。通常應控制發夾的dG≥-1.0 (注：dG是一個用于衡量裂解二聚體或發夾所需要能量的參數，二級結構越穩定，裂解所需的能量越多，dG越小)。
采用DNA Star軟件對美國CDC設計的三套引物探針的發夾結構進行分析，結果（圖7）發現，第一套的下游引物N1R具有一個穩定的發夾結構（dG=-2.3kc/m），第三套的探針N3P具有一個稍微穩定的發夾結構（dG=-1.3kc/m），其余引物和探針均沒有穩定的發夾。
圖7：USCDC引物和探針的發夾結構