新的生物濕／軟樣品制備方法讓電子顯微鏡拍照不再難！

　　電子顯微鏡(SEM)，是幫助我們了解微觀的重要工具。通常，我們進行材料表征時，第一步就是給樣品拍電鏡。因此，樣品拍電鏡前的處理過程就是我們必須要進行的。一般而言，這個處理過程簡單快捷，可當我們在處理軟/濕生物材料時（離體組織，帶細胞材料等），整個過程就變得復雜且耗時了。這一過程包括樣品的固定、脫水、干燥及金屬濺射等固定步驟（梯度脫水就讓人崩潰），還夾雜著脫醇、梯度凍干、離心等可選步驟。往往樣品處理一項，可能耗時幾天。過程復雜，就容易出紕漏，當看著我們因樣品處理失誤而導致的“奇丑無比”的圖片時，真是百感交集。

　　為了解決樣品處理復雜耗時這一難題，韓國科學技術院的Seonki Hong教授研究團隊提出了一種生物濕/軟樣品制備方法，用于SEM分析形貌。該方法利用連苯三酚(pyrogallol，PG)/聚乙烯亞胺[poly(ethylenimine)，PEI]對樣品進行表面處理，涂上涂層后發生氧化交聯反應，在樣品表面形成一層酚-醌/胺膜，鎖住內部水分（避免水分在高真空中產生劇烈地汽化，影響真空度、污染樣品，破壞樣品的微細結構）。這樣，樣品可直接進行電子顯微鏡拍照，大大縮短實驗時間。與此同時，涂覆的保護膜還具有保溫，提供力學支撐的能力。簡單的涂層處理真可謂一舉多得。該研究成果以題為“A nature-inspired protective coating on soft/wet biomaterials for SEM by aerobic oxidation of polyphenols”的論文發表在《Materials Horizons》上。文章第一作者為Hong Key Park。

　　酚胺氧化涂層設計

　　天然研究者發現在水/空氣界面，氧化后的苯酚-醌物質可與多胺發生交聯反應，在空氣/水界面形成酚-醌/胺膜。同樣的，類似的酚類氧化現象也存在于水果之中（Fig.1a,b,c）。發現該涂層能保護軟/濕材料在高真空下不脫水，并起到隔熱作用，防止低溫軟材料熔化/變形。操作很簡單，研究者將連苯三酚(pyrogallol，PG)/聚乙烯亞胺[poly(ethylenimine)，PEI]涂在海綿表面，暴露在空氣中3min后，海綿表面顏色從黃棕色變成深褐色（Fig.1d,e），就像蘋果放在空氣中被氧化，原理非常的相似，這里發生的是氧化交聯反應。

圖1所示：連苯三酚氧化并與聚乙烯亞胺聚合。

　　酚胺氧化涂層樣品電子顯微鏡成像

　　以往在進行掃描電子顯微鏡(SEM)成像之前，濕/軟樣品需要經過處理。以防止成像過程中，樣品在高真空條件下脫水導致結構坍塌和變形。經過酚胺氧化涂層的濕/軟樣品可直接進行掃面成像（Fig.2a）。這一替換將固定、脫水、臨界點干燥、金屬濺射等繁瑣過程替換為一個耗時不到5分鐘涂層步驟。

　　研究者進一步研究涂層方法對于最后成像結果的影響并得出結論：對于小的、微尺寸的樣品，用過濾離心法涂覆涂層。其中聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)微球涂覆酚胺涂層，zeta電位為+18.7 mV（PEI帶正電），而對照組為-22.7 mV。SEM結果進一步表征了這些微球的表面形態，未發現裸球和酚胺處理過的微球在形狀和尺寸上有差異（Fig.2b）。對于柔軟的樣品，由于其高度的柔韌性，不能進行浸涂，則在固體支架上進行自旋涂覆。樣品在涂層和未涂層后沒有明顯的厚度差異（Fig.2c）。

圖2所示：酚胺氧化涂層樣品電子顯微鏡成像。

　　基于此種方法，研究者實現了一系列生物濕/軟樣品進行成像包括植物葉片、豬脂肪、豬腎和豬肝且獲得了一系列組織圖像（圖3）。

圖3所示：酚胺氧化涂層的各種生物組織的SEM圖像。

　　小結

　　最后，研究者得出結論，他們開發了一種通過酚胺氧化交聯反應對生物軟/濕樣品涂層的方法。經過涂層后，在樣品表面形成致密的膜類似于昆蟲的外殼，將水分牢牢地包在內部，保證在電鏡拍攝的高真空環境中，不發生劇烈地汽化，影響成像質量。研究者成功地將數天的處理過程縮短至不到5分鐘，極大地提高實驗效率。

　　同時，涂覆的涂層還具有隔熱及提供力學支撐的作用，這些特點對提高成像質量具有重要意義。