方案2反相微型層析柱的制備實驗

用于質譜分析的蛋白質或多肽樣品

乙腈（HPLC級）甲醇基質溶液三氟乙酸

平頭鑷子GELoader 移液吸頭MALDI-MS板移液吸頭Poros R1、Poros R2 或 Oligo R3 層析樹脂注射器

1.將 GELoader 移液吸頭的尖端壓扁。圖 8.32 所示為兩種最常用的操作方法：

（1）將 GELoader 移液吸頭的細端平放在堅硬的表面上，用一個 1.5 ml 的微量離心管滾過移液吸頭尖端約 Imm 的部位。

（2）用平頭鑷子擠壓 GELoader 移液吸頭的尖端，然后將移液吸頭旋轉一圈，以封閉其末端。

2.制備溶于 70% 乙腈的層析樹脂（PorosR1、PorosR2 或 Oligo R3) 懸液 100~200ul(約 1.5 mg 樹脂/100ul 乙腈）。

步驟③~⑧的操作如圖 8.32(b) 所示。

3.把 20ul 70% 的乙腈裝人壓扁的 GELoader 移液吸頭的尖端，在乙腈上面加人0.5 沁的樹脂懸液，然后通過一個一次性的移液吸頭將裝有樹脂的 GELoader 移液吸頭連接到合適的 1ml 注射器上，用注射器將液體輕輕地壓出。如此，在壓扁的微型層析柱的末端形成一個小的層析柱床。在進行下一步實驗之前，讓所有的液體流出柱底，并使層析柱干燥。

黃色移液吸頭必須被剪切兩次，才能既適合注射器又適合 GELoader 移液吸頭。用來制備層析柱的樹脂懸液的量應該隨著樣品的濃度而變化。

總的說來，當分析物為凝膠分離的低豐度蛋白的肽段時，層析柱的高度應該在 1?6 mm(柱床體積大約為 10~60 nl)。

4.在層析柱頂端加人 20ul 0.1% 的三氟乙酸。由注射器產生的空氣壓力輕輕地將 IOul 0.1% 的三氟乙酸推過層析柱，使其平衡。剩余的 10ul 0.1% 的三氟乙酸則存留在尖端的柱床上面。

注：當微型層析柱被用作 nano-ESI-MS 的預處理步驟時，應以 1% 的甲酸替代三氟乙酸，因為三氟乙酸與電噴霧離子化質譜儀不相容。

5.把蛋白質/多肽樣品加到存留的 10ul 0.1% TFA 上面。

6.通過注射器施加空氣壓力，把液體輕輕地推過層析柱。注意層析柱絕對不能干掉，在柱床的頂端要留有約 2ul 的溶液。

7.用 20ul 0.1% 的 TFA 清洗層析柱，讓層析柱自然流盡。

8.用 0.5ul 的基質溶液，將分析物直接洗脫到 MALDI-MS 板上。這 0.5ul 的基質溶液應分為幾滴（5~10 滴）點在板上。另外，分析物也可用 ESI-MS 分析，此時以甲醇/甲酸/水（50:1:49) 把多肽從層析柱中直接洗脫到毛細管噴針或者微量離心管中。

注：用于從層析柱中洗脫蛋白質的 MALDI 基質或是芥子酸（SA)，或是 2,5-二羥基苯甲酸（DHB)，均溶于 50% 乙腈/0.1% 三氟乙酸中。用來洗脫多肽的基質為溶于含 0.1% 三氟乙酸的 70% 乙腈中的 HCCA。另外，用任何比例的有機試劑都可將分析物直接洗脫到微型離心管中，用于貯存或進一步分析。當分別洗脫到幾個樣品點中時，僅前 2~3 個樣品點中含有分析物，也就是說樣品得到了進一步的濃縮。

層析柱用 100% 乙腈徹底清洗后可以重復使用。層析柱可被重復利用 2~10 次而沒有任何殘留效應，這與層析柱的大小和裝載到層析柱上的分析物的豐度/濃度有關。