| 實驗方法原理 |
在標準培養箱（37°C ) 中用 Leighton 塑料管培養細胞，然后用胰蛋白酶懸浮法收集細胞。 |
| 實驗材料 |
羊水標本 D-PBSA 秋水仙酰胺 胸腺嘧啶核苷 溴脫氧尿核苷 胰蛋白酶 EDTA Histopaque-l077 |
| 試劑、試劑盒 |
完全培養液 胰蛋白酶和EDTA混合液 消毒劑如Virkon 氯化鉀低滲溶液 固定液 過氧化氫溶液 生理鹽水 胰蛋白酶生理鹽水 pH6.8的緩沖液 Leishman染液 |
| 儀器、耗材 |
普通容器 塑料吸管和培養用移液器 塑料Leighton管和蓋 注射器 一次性塑料移液吸管或巴斯德吸管 顯微載玻片 Copline缸 DPX玻片封固劑和蓋玻片 烘箱 加熱板 亮視野相差正置顯微鏡 |
| 實驗步驟 |
試管培養的建立和檢測
1. 將約 10~15 ml 羊水用普通塑料無菌容器送到實驗室。
2. 用帶有無菌塑料混合針的 20 ml 無菌注射器或 10 ml 吸管將樣本分入 3 個 Leighton 管中。按病入和詳細鑒別資料標記試管。如果樣本較少（5 ml 或少于 5 ml )，可用 2 個培養管培養。
3. 離心（150 g，5 min )。
4. 將上清液倒回原來的容器，以供生物化學分析或免疫學分析，例如 α-甲胎蛋白（AFP ) 測定，或者將上清液倒入消毒溶液（Virkon )。
5. 在每個 Leighton 管中用 1 ml 培養液將細胞混懸。
6. 在 37°C 條件下培養 Leighton 管內的細胞。
7. 將細胞靜止培養 5~7 天，使細胞貼壁和建立克隆。
8. 評估細胞生長情況。根據細胞的生長程度，添加 0.5 ml 新鮮培養液或除去培養液后加入約 1 ml 新鮮培養液。
9. 此后，按需要每 2~4 天重新評價細胞的生長狀況，適當更換培養液，直至有足夠細胞收集。通常在培養后 7~12 天收集細胞。如果有可能，在收集細胞的前一天更換培養液。
分散和傳代
10. 將每個培養管加入約 1.5 ml 滅菌的 TE 液，預溫至 37°C 。
11. 從培養管中棄去培養液，然后用 1 ml 滅菌的 TE 液浸洗 1 次。
12. 分散細胞
(a)將 0.2 ml TE 液加入培養管，在 37°C 條件下孵育 1~2 min，使細胞脫落。
(b)用倒置顯微鏡檢査細胞。當細胞懸浮時，加入 1 ml 培養液，然后將培養管放回培養箱。培養液中的血清可終止 TE 液的作用。
13. 傳代
(a)將 0.5 ml TE 液加入培養管，在 37°C 條件下孵育 1~2 min，使細胞脫落。
(b)用倒置顯微鏡檢查細胞。當細胞懸浮時，加入
1.2 ml 培養液，然后將細胞懸液分放入合適數目的繼代培養管。可接種 2~8
個培養管，這取決于最初的細胞密度。使每個傳代培養管中的細胞密度不等，通常是有價值的。這樣，能夠有機會以最佳細胞密度收集培養管內的細胞。
(c)在每個傳代培養管加入新鮮培養液至 1 ml，然后培養。
14. 第 2 天確認細胞已貼壁，然后更換培養液。
培養管內細胞的常規收集
只要備有其他培養細胞，可在原代細胞進行常規收集。如果只保留 1 個培養管，應在收集細胞前繼代培養，或在收集后將細胞傳代。
15. 當準備收集細胞時，將 0.1 ml 稀釋過的秋水仙酰胺（將 1 ml 秋水仙胺酰加人到 9 ml 無菌 D-PBSA 中，作為工作液。然后，每 1 ml 細胞培養液中加入 0.1 ml 工作液，終濃度達到 0.1 μg/ml）加入到每個培養管中。
16. 有必要將細胞培養足夠的時間，以便獲得較多呈圓形的有絲分裂細胞。典型的培養時間為 2~3 h ，但很活躍的細胞可少至半小時，緩慢生長的細胞可達 4 h 以上。
17. 將培養液移入 Virkon 溶液，再將培養管在紙巾上傾流片刻。
18. 加入 2 ml TE 液后，在 37°C 條件下將細胞培養 3 min，以便使細胞脫落。
19. 當細胞懸浮時，加入 7 ml 氯化鉀低滲溶液（0.075 mol/L KCl，用 UPW 配制。將 5.574 g Analair 氯化鉀加入 1 L 超純水中
），在 37°C 條件下將細胞放置 5 min。
20. 離心（150 g，5 min )。
21. 小心地將上清液倒入 Virkon 溶液中，然后將培養管在紙巾上傾流片刻。輕彈培養管，使細胞在剩余的少量培養液中懸浮。
22. 用新鮮固定液（新鮮配制，將 3 份 Analar 甲醇和 1 份 Analar 冰乙酸混合）緩慢固定細胞
(a)輕彈培養管后，滴入 1~2 ml 固定液。不斷搖晃細胞，以免細胞成簇。
(b)加入 3~4 ml 固定液。
23. 離心（150 g，5 min )。
24. 將上清固定液倒入碳酸氫鈉溶液中。
25. 輕輕混懸細胞后，加入 5 ml 固定液。
26. 通過離心、倒掉上清固定液和再固定，更換固定液，即重復操作步驟 9~11。
27. 將細胞離心后，倒掉上清液，用剩余的固定液混懸細胞，制備細胞涂片 (見后述的玻片制備步驟）。
胸腺嘧啶核苷同步化收集
1.
在收集細胞的前一天早上，用添加胸腺嘧啶核苷（用 D-PBSA 制備 15 mg/ml 儲備液，過濾除菌。將 0.1 ml
胸腺嘧啶核苷儲備液加入到 10 ml 培養液中。在收集細胞前更換使用胸腺嘧啶核苷培養液。在培養液中的終濃度應為 0.15
mg/ml）的培養液換液（胸腺嘧啶核苷的終濃度為 0.15 mg/ml )。
2. 收集細胞當天的早些時候，用預溫的培養液浸洗去除胸腺嘧啶核苷。然后，倒掉培養液，將細胞浸洗兩次。加入 1 ml 不含胸腺嘧啶核苷的培養液，這種培養液可緩解胸腺嘧啶核苷的阻斷作用。緩解時間取決于計劃收集細胞的時間。
3. 將細胞培養 4 h ，然后加入 0.1 ml 稀釋的秋水仙酰胺。
4. 將細胞繼續培養 2 h ，然后按照培養管常規收集法收集細胞（按照本方案前述的培養管內細胞的常規收集，從操作步驟 2 開始）。
溴脫氧尿核苷秋水仙酰胺過夜收集
1. 在收集的前一天早上更換培養液。
2. 同天下午在每 1 ml 培養液中加入 0.1ml BUdR-秋水仙酰胺液（BUdR 的終濃度為 25 μg/ml，秋水仙酰胺為 0.04 μg/ml )。
3. 次日早上（處理約 20 h 后），將 BUdR-秋水仙酰胺液倒入含有金精石的可密封容器中。然后，將 2 ml 預溫的 TE 液加入培養管，孵育 3 min，使細胞脫落。
4. 檢査到細胞已懸浮時，加入 7 ml 0.075 mol/L KCl 低滲溶液。將細胞培養 5 min。
5. 離心（150 g，5 min )。
6. 將低滲上清液倒入金精石容器中。
7. 輕輕混懸細胞，按本方案前述的培養管內細胞常規收集，從操作步驟 6 開始緩慢固定細胞和繼續收集。
制備玻片
1. 使用清潔的玻片。可以購買預清潔的玻片。使用前在每張玻片上加 1 滴新鮮固定液，立即用紙巾擦凈，這有助于清潔玻片。如能夠控制周圍的環境，應在 20~25°C 和 40%~50% 相對濕度的環境下制備玻片。
2. 從 1~3 cm 的高度將 1 滴細胞懸液滴加在每張玻片上。使液滴自然晾干。
3. 用相差顯微鏡確定分散質量。如果分散滿意，可制備其余的玻片。如有必要，在細胞懸液中再加入少量固定液，調整細胞密度。
4. 在某些情況下，需改進分散方法，以下的建議可能是有幫助的。
(a)先在玻片上吹一口氣，然后從 1~3 cm 的高度將 1 滴細胞懸液滴加在玻片上。使液滴自然晾干。
(b)無論在玻片上吹氣或不吹氣，將 1 滴細胞懸液加在玻片上。放置幾秒鐘后，在液滴尚未干燥前，再加滴 1 滴新鮮固定液。然后，使玻片晾干。
(c)不管在玻片上吹氣或不吹氣，將 1 滴細胞懸液加在玻片上。放置幾秒鐘。當干燥的表面凹陷或可見 Newton 環時，將 1 滴新鮮固定液加在上面。使玻片晾干。
(d)如果分散質量還不滿意，將固定的細胞懸液放在冰箱中固定過夜。第 2 天再制備玻片。
用胰蛋白酶進行 G 帶顯帶
1.
可在胰蛋白酶（將 10 ml 超純水加入小瓶中，按照產品使用說明配制 5% (w / v )
胰蛋白酶液）消化前預處理玻片，但依據玻片的制備后時間也可不作處理。新鮮制備的玻片用過氧化氫預處理效果好，而制備時間較長的玻片用濃 Hank’s
鹽溶液預處理效果好。Coplin 缸是合適的染色器皿。也可以使用未作預處理的玻片。
2. 可采用以下的預處理方法。
(a)用 5 % 過氧化氫將新鮮制備的玻片（晾干后 1 h ) 浸泡 20 s~2 min 。
(b)用 60°C 烘箱將新鮮制備的玻片烘烤數小時或過夜，使玻片老化。然后，在 5×HBSS 中將玻片浸泡 5 min。
(c)在 pH 6.8 的緩沖液中將制備后 1 天或較長時間的玻片浸泡 60 s。
3. 用 pH 6.8 的緩沖液將玻片充分浸洗。
4. 用鹽溶液配制的 0.14% 胰蛋內酶浸泡玻片 3 s~2 min。
5. 用 pH 6.8 的緩沖液將玻片充分浸洗。
6. 染色前用 pH 6.8 的緩沖液稀釋 Leishman 染液（1 : 4 ) （通常用 4 份 pH 6.8 的緩沖液稀釋 1 份 Leishman 染液）， 然后將玻片染色 4 min。
7. 用自來水沖洗玻片，然后引流掉或小心吸干水分。
8. 在 400× 亮視野顯微鏡下分析顯帶結果。如果顯帶較暗，可用 pH 6.8 的緩沖液或甲醇脫色，并可重復操作。如果顯帶過度，用另外的玻片，采用不同的胰蛋白酶處理時間或改變預處理方法，重新操作。
9. 將玻片在熱盤上 ( 75°C ) 放置數秒鐘，以保證玻片完全干燥。然后，用 DPX 和蓋玻片封片。
染色體制圖在本章后面敘述（見方案 27. 9)。
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| 注意事項 |
1. 安全提示
(a)戴手套和穿實驗衣。所有樣本都應在 Ⅱ 級微生物安全柜中的無菌條件下處理。
(b)應將丟棄的培養液和低滲上清液（但不是固定液）倒入消毒溶液中，如 Virkon 或次氯酸鹽。固定液應倒入碳酸氫鈉溶液中，以便使酸中和。2 h 后，將這兩種廢液倒入有充足流水的排水系統。
(c)溴脫氧尿核苷（BUdR ) 是一種已知的誘變劑，可選擇使用。在從事涉及這種化學制削的任何工作前，應當承諾適當的當地安全評價（如 COSHH )。可將含有過量化學物質的溶液和上清液倒入盛有金精石或類似吸收物質的可密封容器中，然后焚化處理。
(d)固定和準備玻片時使用甲醇和乙酸的操作應在煙霧通風櫥中進行。
2. 注意事項
(a)通過用胰蛋白酶分散細胞克隆能促進細胞的快速生長（見下面的分散和傳代方法）。如果需要大量的細胞，將細胞傳到幾個 Leighton 管或培養瓶，以有利于細胞生長，獲得較多細胞。
(b)血染羊水樣本的細胞生長不如清澈樣本好。處理這種樣本的一種方法是利用密度梯度離心（如 Histopaque ) 將羊膜細胞與污染的紅細胞分離。
(c)如果不先吸去血染的培養液，在 6~7 天評估嚴重血染樣本的細胞生長情況通常是不可能的。可將培養液收集入另外的試管中。如果原有試管的細胞能夠生長， 可將收集的培養液丟棄。如果需要， 也可將收集的培養液進一步培養。
(d)無論如何不希望丟棄原來的細胞懸液時，在第 1 次換液時可增加試管培養。
3. 注意事項
(a)可在 -20°C 條件下儲存不同固定階段的固定細胞懸液。在制備玻片前換固定液 2 次。
(b)當選擇傳代或只剩下
1 個培養管時，可采用保留收集法。這種方法需要在收集的開始階段加入無菌的秋水仙酰胺和 TE 液。在細胞脫落后，加入低滲溶液前，將細胞移入另 1
個離心管。在原始培養管中加入新鮮培養液。第 2 天當細胞貼壁后應更換培養液，以便除去殘留的胰蛋白酶和秋水仙酰胺。
(c)如果收集的細胞中的分裂中期細胞過少，可選擇使用以下方法：
(i)將細胞傳到培養瓶中。當細胞附著時，將培養瓶與水平面保持輕微的角度。用這種方法斜置培養瓶能使前緣細胞橫跨整個培養瓶的寬度，前緣細胞的生長速度總是很快。
(ii)用低濃度的秋水仙酰胺處理細胞過夜。
(d)可通過胸腺嘧啶核苷同步化或在有溴脫氧尿核苷的條件下經秋水仙酰胺過夜處理，產生用于高分辨分析的較長染色體。然而，這兩種方法對于指數生長期細胞的效果很有效，并需要對細胞生長作出細致評價。
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