一、非變性凝膠的制備在非變性凝膠緩沖液中，制備水平的 0.8% 瓊脂糖凝膠，規格約為 8 cm X 5.5 cm X 3 mm。
（1）將瓊脂糖粉末加到有 3?4 倍體積的非變性凝膠緩沖液的錐形瓶中，稱重。 （2）用倒置的燒杯蓋住錐形瓶，放到微波爐中加熱，直至瓊脂糖熔化。 （3）再稱重，如必要加水補到原來的重量。 （4）讓瓊脂糖在 45°C 水浴中冷卻。 （5）把梳子插到凝膠灌制裝置中央，倒入瓊脂糖溶液。 （6）讓瓊脂糖凝固。 （7）把凝膠放入裝有非變性凝膠緩沖液的水平電泳裝置中，保證凝膠完全浸沒。 小心拔出梳子。 二、蛋白質復合體的鑒定2.用純化的蛋白質在有利于蛋白質復合體形成的條件下，共同溫育目標蛋白。 要確定細胞提取物中的蛋白質是否能與目標蛋白結合。在適于形成蛋白質復合體的條件下，取 45]ug 溶解的細胞提取物與 5ug 的純化蛋白一起溫育。 3.用 2X 上樣緩沖液以 1:1(體積比）混合蛋白樣品，每份 2~5ug。 蛋白樣品應該包括每個單獨蛋白（或使用的細胞提取物），在第②步驟中將混合物孵育。 4.加樣到加樣孔中（一般約 20ul 孔），室溫下恒壓 50V 電泳 lh。 5.在染色液中，染凝膠 20 min。在脫色液中脫色，直到能清晰地辨別蛋白條帶 (圖 10.16)。 6.在甘油中泡 5 min，37°C 在兩層玻璃紙間干燥 24 h 以干燥凝膠。
 三、蛋白質復合體的組分的分離和鑒定7.在相鄰泳道中，加 2 個相同的蛋白質復合體樣品到 0.8% 瓊脂糖凝膠，室溫下恒壓 50V 電泳 lh。 8.用鋒利的刀片從凝膠上分離 2 個泳道的凝膠。 9.按步驟⑤染 2 個泳道中的一個泳道膠條。另一個泳道的膠條浸在非變性凝膠緩沖液中（緩沖液 A)。 10.鑒定含有蛋白質復合體的染色凝膠區域。從對應蛋白質復合體位置的未染色凝膠區域，切下瓊脂糖條帶，作為染色凝膠參照。 11.把含有復合體的未染色凝膠碎片放入 Ultrafree-DA 裝置中。裝置中的凝膠噴霧器能通過離心，把凝膠條轉化成細小的噴霧。把過濾裝置放到濾瓶中，室溫或 4°下 5000 g 離心 lOmin。凝膠碎片必須通過噴霧器的口，以便將凝膠轉變為細小泥漿。 凝膠顆粒通過過濾器被捕獲，然后棄掉（過濾器不可重復使用）。 12.將過濾瓶中的蛋白質樣品轉移到微型超濾濃縮器中（所用的截點大小，由所研究的蛋白質的大小決定）。 13.14000 g 離心微量濃縮器，直至樣品體積剩到 10~20ul。 蛋白質保留在微量樣品儲存池的膜上。 14.把微量管倒置在新的瓶中，回收濃縮蛋白質。l000 g 離心 3 min。 細節參見供應商的說明書。 15.鑒定蛋白質復合體條帶各組分的大小，用 SDS-PAGE 分析濃縮的蛋白質（見第 2 章方案 1)。 凝膠中丙烯酰胺的百分比，取決于要研究的蛋白質的大小（見第 2 章表 2.2)。 或者，可用 ESI-MS 或 MALDI-MS 分析蛋白質（要求約 4Pmol)(見第 8 章）。 展開 | 
