1.凍干的蛋白質底物溶解在 1% 的碳酸氫銨中，控制使用盡量少的溶液體積，以達到較高的底物濃度。 當蛋白質底物很微量（如小于 1mg) 時，加入 Tween-20 到碳酸氫銨中使其終濃度為 lg/L，否則底物（和酶）會吸附在管壁上，造成樣品損失。碳酸氫銨是一種易揮發的緩沖溶液，通過冷凍干燥輕松去除。PH8 的不易揮發的緩沖溶液，例如 0.05 mol/L Tris-HCl （pH8.0~8.3）可以代替碳酸氫銨。 2.將胰酶加到底物中去。對于變性的蛋白質（比如還原或烷基化的蛋白質），底物與酶的比例為 200:1 到 50:1; 對于天然蛋白質，比例可以高達 1:1; 對于凝膠中的蛋白質消化，不管底物的量是多少，用0.5~1.Oug 的胰酶（一般而言，對于考馬斯亮藍染色的蛋白質用量小于0.5ug)。 3.設無蛋白質樣品的對照反應混合物（如果樣品充足，可設不加胰酶的第二份反應液），作為 RP-HPLC 肽段作圖的對照。 4.反應液置于 37°C 保持 16 h(也可過夜) 5.把樣品轉移到 RP-HPLC 層析柱上以停止反應，并開始肽譜分析，或把反應液放到冰上以減慢反應。 或者加入特異性的抑制劑以終止反應。抑制劑如 N-α-甲苯磺酰賴氨酰氯甲酮（N-α-tosyl-L-lysyl chloromethyl ketone)，或 N-甲苯磺酰-L-丙氨酰氣甲酮（N-tosyl-L-pHenylalanine chloromethyl ketone;TPCK)，或 PMSF，加人量要多于所用的胰酶量。因為胰酶在低 pH 值的情況下活性不高，也可以通過調節反應混合物的 pH 值為 2~3 來終止反應（比如加人易揮發的乙酸或三氟乙酸）。
 展開 | 