一、可溶性酵母蛋白的酶解1.將 1mg 冷凍干燥的可溶性酵母蛋白加入0.5 ml 的變性溶液中，37°C 溶解 15 min。 2.加入 IAA 至終濃度為 50 mmol/L，然后將樣品置于暗處 30 mm，室溫條件下使半胱氨酸殘基烷基化。 3.樣品透析：將樣品溶液在 100 ml 的透析液中室溫透析 lh，以除去鹽和低分子量物質。 4.更換透析液，重復步驟③兩次。 5.向樣品中加人 20ug 胰酶，37°C 孵育 lOmin。 6.用 10 mmol/L Tris-Cl(pH8.5) 將樣品稀釋 2 倍（至 1.Oml)，加入 CaCl2 至終濃度為 1mmol/L。用 pH 試紙驗證 pH 值是否在 8 到 9 之間。 若變性液中含 SDS(步驟①），則必須使其在樣品液中的終濃度低于 0.1%，以便胰酶有效消化。 7.37°C 條件下胰酶消化過夜。 8.用 2ul 的 TFA 酸化樣品以終止消化，用 pH 試紙確證溶液 pH 值低于 3。 也可用其他方法來溶解（步驟①）和消化蛋白質（例如可不加 SDS，使用其他還原劑，若鹽濃度很低則不用透析等）。不過在用 SCX 色譜進行多肽分離前，鹽終濃度一定要低于 20 mmol/L(包括 Tris-HCl 和蛋白質水解產生的鹽），且上樣前需確保溶液的 pH<3。若鹽濃度高于 20_〇 1/L，可用膜透析（見步驟③和④），或依制造商提供的指導用 Ql8 固相抽提（SPE) 柱（Vydac) 除鹽。 二、SCX 色譜柱的準備9.以 SCX 緩沖液和 SCX 色譜柱為基礎建立 HPLC 系統。 10.設置柱流速為 200ul/min，獲得空白梯度。 用于多肽洗脫的緩沖液 B 在約 5%~35% 的區間應采取平緩梯度（見表 8.12)，這樣可使凈電荷為+2 的多肽片段（為胰酶酶解的主要產物）比線性梯度洗脫有更好的分離效果。
 11.檢測 SCX 柱的性能 （1）將溶于緩沖液 A 中的 200pmol 多肽標準品加至 SCX 柱上。 （2）用 UV 檢測儀檢測多肽在 214nm 的吸收。 應能獲得 6 個完全分離的且峰寬小于 1min 的洗脫峰。 三、SCX 色譜分離酵母肽混合物12.將酸化的（pH<3) 的酵母酶解多肽樣品加到柱上，用緩沖液 A 洗柱 5~10min，直至 UV 檢測峰返回基線。 13.開始梯度洗脫，每分鐘收集 200ul 洗脫組分。 圖 8.44 所示為利用該技術分離 Img 酵母蛋白的洗脫圖譜。該技術可以分離多達 5 mg 的多肽，可根據樣品量選用更大或更小的柱子。 14通過離心蒸發濃縮樣品體積至 50~100ul。
四、SCX 色譜分離組分的 RPC 層析將納升級的反相色譜毛細管 LC 串聯離子阱質譜儀，進行在線檢測，其靈敏度最大，可鑒定的多肽最多。串聯后，多肽的檢測水平可達 1~5 fmol，并且串聯質譜的獲取速度達 2000 個圖譜/h。 15.將一支內徑 75 um、長 20 cm 的桂化毛細管拉成針尖。 有很多方法可用于拉制電噴霧的細針。最簡單的方法是將一重物（用膠帶紙）粘在針上，然后用微火焰將毛細管拉尖。另外，在方案 5 中介紹的激光拉針器也很有效。不過，拉好的針或預裝柱也可以買到（例如，NewObjective，Cambridge，Massachusetts)。 16.取一根已拉尖的 75 um 的硅化毛細管，其中填充 5um、200A 的 C18 顆粒，柱床長度 12 cm(填充毛細管的方法詳見方案 4 或方案 5)。 毛細管的針尖不僅可以填料，而且還可充當 MS 的電噴霧針。 17.按照下列步驟連接微型四通的 4 個臂： (1)來自 HPLC 的流動相（lOOjul/min); (2)用于分流（50ym 內徑 X50 cm) 的限流毛細管；流速 99.7ul/min; (3)一根連接到高壓電源（1.8kV) 的金導線； (4)拉尖的納升級反相毛細管柱（步驟?），流速為 300nl/min。 18.將 HPLC 的流速調至 100u1/min，利用微型四通進行分流，使流向反相層析柱的流速為 300nl/min。 19.取經 SCX 色譜分離的組分 50ul, 離線加壓上樣（pressure-loadoff-line)，每次加樣 10 ul 或更多，然后進行梯度洗脫。 20.向 ESI 提交洗脫峰并在離子阱質譜中分析。 MS 以兩種模式運行，即 MS 模式（測定多肽離子的 m/z) 和 MS/MS 模式（多肽測序）。 在短短的 1 h 的反相 LC-MS/MS 分析中，數據依賴型的 MS/MS 掃描可進行上千次肽段測序，將從 MS 掃描中所選擇測序的多肽設定為「on the fly」，從每個 MS 圖譜中選擇 5 個肽段進行測序（裂解）。
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