施一公組首次報道人源剪切體原子分辨率結構

　　2017年5月12日，清華大學生命學院、結構生物學高精尖創新中心施一公研究組于《細胞》（Cell）在線發表了題為《人源剪接體的原子分辨率結構》（An Atomic Structure of the Human Spliceosome）。這是第一個高分辨率的人源剪接體結構，也是首次在近原子分辨率的尺度上觀察到酵母以外的、來自高等生物的剪接體的結構，進一步揭示了剪接體的組裝和工作機理，為理解高等生物的RNA剪接過程提供了重要基礎。

　　在真核生物細胞內，大多數基因是不連續的，它們的編碼區（exon）被稱為“內含子（intron）”的非編碼序列隔斷。在基因表達過程中，內含子需要經過“剪”和“接”這兩步化學反應被去除，從而使得編碼區可以連接成不同的信使RNA（mRNA）。同一個基因，因為內含子的邊界和數量不同，經過剪接，便可以產生出多種編碼蛋白的mRNA。RNA剪接是所有真核生物特有的過程，是真核生物“中心法則”的關鍵步驟之一，也被認為是真核生物復雜性的重要分子基礎。RNA剪接過程必須高度精準，任何錯誤都有可能導致基因表達異常乃至疾病的發生。據統計，1/3以上的遺傳性疾病與RNA剪接異常有關。

　　RNA剪接這一復雜的生理過程由剪接體（spliceosome）來執行。剪接體是細胞中已知的最為復雜的大分子機器，分子量巨大并且高度動態，主要由蛋白質-核酸形成的復合物（ribonucleoprotein，RNP）組裝形成，它在前體信使RNA（pre-mRNA）上完成識別、組裝、激活、催化等一系列過程，并最終在反應結束后解離成許多小的功能單元，以進入下一個反應循環。根據剪接體的組成與構象的不同，可以將剪接體分為E、A、B、Bact、B*、C、C*、P、ILS等若干狀態（圖1）。

圖1. 剪接反應過程示意圖

　　解析剪接體的高分辨率結構對于理解剪接反應的機理至關重要。2015年8月，施一公課題組在世界上率先解析了酵母剪接體的高分辨率結構，在2016年又陸續報道了酵母剪接體在不同工作狀態下的高分辨結構，提供了迄今為止最為全面和清晰的剪接體結構信息，揭示了RNA剪接的分子基礎，極大地推動了這一領域的發展。

　　然而與酵母剪接體相比，以人類為代表的高等生物的剪接體組成、組裝和調控更為復雜，其結構研究也因為組成的復雜性和構象的不穩定性而進展緩慢。由于超過1/3的人類遺傳病與剪接過程中的錯誤直接相關，解析人源剪接體的結構不僅能幫助理解剪接反應的化學本質，更能促進對一些疾病發病機制的理解，并為研發針對剪接體的相關藥物提供可能。因此人源剪接體的結構解析是極其重要并亟需解決的難題。

　　在最新發表的《細胞》研究長文中，施一公研究組利用修飾過的pre-mRNA，在體外進行人源剪接體的組裝，把剪接反應鎖定在了第一步反應之后與第二步反應之前的狀態，即C*狀態。由于人源剪接體非常不穩定，研究人員使用化學交聯劑在溫和的條件下對剪接體進行固定，成功獲得了穩定的人源剪接體樣品，并采用單顆粒冷凍電鏡重構出了3.8埃的近原子分辨率結構（圖2和圖3）。

圖2. 人源剪接體的結構示意圖

圖3. 人源剪接體與酵母剪接體的比較

　　在該結構中，剪接體核心區分辨率高達3.0-3.5埃，清晰地展示了由20余個蛋白與RNA組成的催化反應中心的結構（圖4 ）。同時，他們觀察到與第二步反應密切相關的剪接因子所呈現出的特定構象，對于穩定反應活性中心以及催化第二步轉酯反應至關重要。該結構的解析為揭示第二步反應過程中剪接體的構象變化以及3 剪接位點的識別提供了重要的結構依據。

圖4 人源剪接體的催化中心與調控機制

　　施一公教授為本文通訊作者； PTN項目15級博士生張曉峰、結構生物學高精尖創新中心卓越學者閆創業、醫學院博士生杭婧為本文共同第一作者，閆創業博士同時為本文共同通訊作者；生命學院博士后Lorenzo I. Finci 參與了這項研究；清華大學冷凍電鏡平臺主管雷建林研究員協助數據收集，平臺工作人員李曉梅、李曉敏在數據收集過程中提供了幫助；本課題得到了清華大學冷凍電鏡平臺，高性能計算平臺、國家蛋白質設施實驗技術中心（北京）的大力支持；本工作主要獲得北京市結構生物學高精尖創新中心的經費支持，并獲得了國家自然科學基金委以及科技部的資助。