昆蟲全基因組DNA的提取

實驗概要

利用改進的CTAB 法提取昆蟲全基因組DNA。

主要試劑

1. 蛋白酶K[美國Merck公司]

2. 三羥甲基氨基甲烷(Tris)[美國Amresco公司]

3. Taq DNA聚合酶及dNTP[NEB公司]

4. 瓊脂糖及溴化乙錠(EB)[美國Amresco公司生產]

5. 乙二胺四乙酸鈉(Na2EDTA)[美國Amresco公司]

6. 苯酚、氯仿、異戊醇、無水乙醇等[國產分析純]

7. 電泳緩沖液TBE：濃貯存液5×TBE：54.0 g Tris堿，57.1 g硼酸，20 ml 0.5 M EDTA，pH=8.0，加蒸餾水定容至1 L，工作液為稀釋的0.5×TBE

主要設備

1. 高速冷凍離心機(3K-30)[德國Sigma公司]

2. 恒溫水浴鍋[北京六一儀器廠]

3. 電泳儀[美國Bio-Rad公司]

4. 水平電泳槽[美國Bio-Rad公司]

5. 凝膠成像系統(Gel Doc EQ)[美國Bio-Rad公司]

6. 4℃、-20℃冰箱[日本Sanyo公司]

7. 紫外分光光度計(Beckman Du 650)[日本Sanyo公司]

8. 高壓滅菌鍋[日本Sanyo公司]

實驗材料

煙粉虱成蟲

實驗步驟

改進的CTAB 法提取昆蟲全基因組DNA:

1. 加入 50 μL TE 緩沖液，充分懸浮細胞樣品；

2. 加入 60 μL 10% SDS 溶液，10 μL 20 mg/mL 蛋白酶K，溫和混勻，37℃溫育 1 h；

3. 加入 100 μL 5 mol/L 的 NaCl 溶液，上下顛倒離心管十多次，充分混勻；

4. 加入 80 μL CTAB/NaCl 溶液，溫和混勻，65℃下溫育 10 min；

5. 加入 700 μL 氯仿/異戊醇，溫和混勻，12000 r/min 高速離心 2 min；

6. 吸取上清至另一干凈離心管，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，上下顛倒混勻，12000 r/min 高速離心 2 min；

7. 吸取上清至另一干凈離心管，加入 2 倍體積冰冷的無水乙醇沉淀 DNA，溫和混勻；

8. 離心（12000 r/min，30 min，4℃），徹底去除上清；

9. 用 300 μL 70% 預冷的乙醇洗滌沉淀，離心（12000 r/min，15 min，4℃），棄上清，再離心幾秒，用移液器徹底除去酒精，風干；

10. 沉淀溶于 100 μL TE 溶液中，-20℃保存；

11. 以紫外分光光度法和 0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 濃度和質量。

DNA的濃縮與純化：               

1. 將樣品置于 1.5 mL 離心管中，在每一樣品中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇溶液，將管中樣品振蕩混合成乳狀液體；

2. 室溫下，12000 r/min 離心 1 min；

3. 吸取上層水相層到另一潔凈的離心管中，再次加入等體積的酚/氯仿/異戊醇溶液，混勻，室溫下 12000 r/mi n離心 1 min；

4. 吸取上層水相轉移到另一潔凈離心管中，加入等體積的水飽和乙醚，混勻，靜置 5 min 待有機相與水相分層，棄上清乙醚；

5. 置于 68℃溫育 10 min，不時用手指彈動管壁，使乙醚充分揮發；

6. 加入 1/10 體積的乙酸鈉溶液（3 mol/L，pH5.2），上下顛倒離心管使溶液充分混勻；

7. 準確加入 2 倍體積的預冷的無水乙醇，上下顛倒混勻，-20℃靜置 1 h使 DNA 充分沉淀；

8. 4℃，12000 r/min 離心 10 min，棄上清；

9. 加入 70% 預冷的乙醇至管中 2/3 體積，混勻漂洗以去除殘余的鹽，高速離心（4℃，12000 r/min，5 min），棄盡上清；

10. 室溫放置 15 min 左右，使乙醇完全揮發，加入適當體積的雙蒸水或 TE 溶液重溶 DNA 沉淀。