昆蟲細胞共轉染實驗

草地夜蛾（Sf 9）細胞含目的基因的重組桿狀病毒轉移質粒陽性對照載體：pVL 1392 - XylE

ORF 1629 缺失的線性 AcMNPV DNA轉染緩沖液 B轉染緩沖液A500 mmol／L 兒茶酚／50 mmol／L 硫酸氫鈉

含 10％ 胎牛血清（FBS）的 TNM-FH 昆蟲培養基60 mm 組織培養皿27℃ 加濕培養箱倒置顯微鏡15 ml 錐形離心管帶有 GH-3.7 水平轉子的4℃離心機

1. 接種 2 × 10⁶ 細胞于 60 mm 培養皿中，接種 3 個培養皿，在含 10％ FBS 的 TNM- FH 昆蟲培養基中培養，27℃ 培養直到細胞貼壁。

細胞在平坦光滑的表面才能貼得更加牢固，這個過程常常需要大約 5 min。如果在此時間后細胞 還沒有貼壁，說明細胞狀態不好或所用的培養皿不好（如有蓋培養皿不能用于組織培養）。

昆蟲細胞的狀態十分重要，只有能快速分裂的細胞才能使用。

2. 待細胞貼壁后，在離心管中加入 0.5 μg ORF 1629 缺失的線性 AcMNPV DNA 和 2～5 μg 重組桿狀病毒轉移質粒。輕輕振蕩混勻，放置 5 min， 再加入 1 ml 轉染緩沖液 B。

3. 制備陽性對照：在離心管中加入 0.5 μg ORF 1629 缺失的線性 AcMNPV DNA 和 2 μg 陽性對照載體 pVL 1392-XylE DNA。輕輕振蕩混勻，放置 5 min， 再加入 1 ml 轉染緩沖液 B。

4. 第一個培養皿（步驟 1）進行共轉染試驗，做好記號。吸出舊培養基，加入 1 ml 轉染緩沖液 A，必須保證液體全部覆蓋細胞。

5. 第二個培養皿（步驟 1）作為陽性對照，做好記號。吸出舊培養基，加入 1 ml 轉染緩沖液 A，同步驟 4。

6. 第三個培養皿（步驟 1）作為陰性對照，做好記號。吸出舊培養基，加入 3 ml 新鮮的 TNM-FH/10％ FBS 培養基，不加入任何 DNA。

7. 將 1 ml 步驟 2 制備的溶液（含有目的基因的載體）逐滴加入共轉染培養皿中，每加入 3～5 滴，來回地晃動平皿，混合液滴。

在此過程中，可能會形成磷酸鈣/DNA 沉淀，這種沉淀對于轉染是有利的，它是以乳白狀形式出現的。

8. 將 1 ml 步驟 3 制備的溶液（含有陽性載體）逐滴加入陽性對照培養皿中，同步驟 7。

9. 將此三塊板放入 27℃ 培養箱中培養 4 h。

鈣沉淀的暴露時間對于獲得良好的轉染結果十分重要。如果培養的時間太長，細胞的存活率會有很大的下降，對于不同的細胞系，最適培養時間也不同。對于 Sf 9 細胞，最適培養時間是 4 h。

10. 4 h 后，吸出共轉染平皿和陽性對照平皿中的培養基（不包括陰性對照平皿）。每個板中加入 3 ml 新鮮的 TNM-FH/10％ FBS 培養基，來回地晃動平皿，再次吸出所有的培養基。每個板中加入 3 ml 新鮮的 TNM-FH/10％ FBS 培養基。27℃ 培養 4～5 天。

沒有必要更換陰性對照平皿中的培養基。

11. 4 天后，在倒置顯微鏡下觀察三塊平皿中的感染情況，將共轉染平皿與陽性對照平皿和陰性對照平皿對比。

被感染的細胞比未被感染的細胞大，細胞核也大。由于從轉染后的早期就停止分裂，與沒有轉染的細胞相比細胞的密度要低很多。而且，轉染了的細胞不能很好的貼壁，懸浮在培養基中的細胞占很高的百分比。

12. 5 天后，收集共轉染平皿和陽性對照平皿的上清。用噬斑試驗確定病毒滴度或用終端稀釋試驗估計病毒滴度（見病毒儲液滴度測定實驗）。

13. 裂解轉染細胞（對于非分泌型重組蛋白）檢測目的蛋白的表達或將上清（對于分泌型重組蛋白）分成多份，進行相應試驗。

除非對目的蛋白有靈敏的檢測手段，否則在這一步重組蛋白不能被發現。

14. 加入 100 μl 500 mmol/L 兒茶酚/50 mmol/L 硫酸氫鈉到陽性對照平皿檢測 XylE 蛋白的表達。大約 5 min， 被感染的細胞變成亮黃色。

15. 將轉染上清液轉入無菌的 15 ml 的離心管中，4℃，1000 g 離心 10 min。將病毒上清液放入新的無菌管中，避光，4℃ 保存。

16. 擴增病毒上清，以獲得可用于生產重組蛋白的高滴度病毒儲液（見桿狀病毒儲液制備實驗）。

在共轉染前，需要制備 ≥ 10 μg 提純的質粒 DNA。注意質粒要盡可能的干凈，使用 不純的質粒，細胞在轉染后可能溶解，導致病毒的滴度很低。轉染后 24 h， Sf 細胞的存活率應 > 97％。