星形膠質細胞來源于2天的大鼠。斷頭后的大鼠大腦收集在含有11mM 碳酸氫鈉，71mM葡萄糖和1%抗菌素的DMEM溶液中。移除腦膜，血管和白質。大腦皮層用機械分裂法進行勻漿，然后將細胞懸液經230μm，104μm 和73.3μm孔的鐵絲網依次過濾。然后用700g 速度10分鐘離心收集細胞，用含有10%胎牛血清的DMEM重懸細胞。最后，以2.0×105細胞/cm2將細胞接種到培養皿中，將培養皿放入37°C 5%CO2 濕潤培養箱中進行培養。7天后更換培養液，10天左右細胞能鋪滿培養皿。
選用2天的大鼠進行星形膠質細胞培養，而且培養皿沒有經過多聚賴氨酸預處理（因為在沒有多聚賴氨酸的情況下，神經元細胞貼壁能力非常弱），可以最大程度的減少皮質神經元的污染。
與神經元相似，星形膠質細胞體外培養5、10、20天可用來評估與年齡相關的細胞形態變化。