普通PCR、實時熒光定量PCR和數字PCR對比分析

 提起 PCR，在生物及其相關行業內可謂如雷貫耳，無人不知無人不曉，其影響之深，應用之廣可見一斑。
    1985 年，美國 PE-Cetus 公司的 Mullis 等人發明了聚合酶鏈反應（PCR），實現了在試管中模擬細胞內的 DNA 復制。然而，采用 E-coli DNA 聚合酶進行 PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯。1988 年 Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌 (thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱 DNA 聚合酶。 耐熱 DNA 聚合酶的應用使得 PCR 能高效率的進行，隨后 PE-Cetus 公司推出了第一臺 PCR 自動化熱循環儀，從此拉開了 PCR 大展拳腳的序幕。
    根據 PCR 的發展進程，本文將對普通 PCR、實時熒光定量 PCR 和數字 PCR 這三代 PCR 進行分析，期望對 PCR 感興趣的讀者能從中有所收獲。

普通 PCR

基本原理
    PCR（聚合酶鏈式反應）是一種體外 DNA 擴增技術，是在模板 DNA、引物和 4 種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于 DNA 聚合酶的酶促合反應，將待擴增的 DNA 片段與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經「高溫變性—低溫退火 —引物延伸」三步反應的多次循環，使 DNA 片段在數量上呈指數增加，從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。DNA 的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。

PCR 反應體系舉例

儀器與耗材

    基于聚合酶制造的 PCR 儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度、復性溫度和延伸溫度之間很好地進行控制。這些儀器主要用變溫鋁塊、變溫水浴及變溫氣流的方式達到熱循環的目的，各有其優缺點，在此不再贅述。

結果檢測

    PCR 反應擴增出很高的拷貝數，下一步檢測就成了關鍵。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是最常用的檢測手段。電泳法檢測特異性不太高，引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判，但因為其簡捷易行，成為了主流檢測方法。

應用

    PCR 是一種用于放大擴增特定的 DNA 片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊 DNA 復制，最大特點是能將微量的 DNA 大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的 DNA，就能用 PCR 加以放大，進行比對。這也是「微量證據」的威力之所在。

實時熒光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR） 

基本原理

    qPCR 技術是在反應體系中加入熒光報告基團和熒光淬滅基團，隨著 PCR 反應的進行，擴增產物不斷積累，導致熒光信號不斷積累， 從而利用熒光信號的變化實時監測整個 PCR 進程。
    根據 PCR 定量原理公式可推導出， 模板起始拷貝數的對數與閾值循環數呈線性關系，模板起始拷貝數越多，熒光信號達到閾值的循環數越少，即 Ct 值越小。利用已知起始拷貝數的標準樣品繪制標準曲線，根據熒光基團發出的熒光強度與 PCR 擴增產物的數量呈對應關系， 只要對熒光信號進行實時監測并得到未知樣品的 Ct 值，即可通過標準曲線計算未知樣品的起始拷貝數。
    Ct 值指 PCR 擴增過程中，擴增產物的熒光信號達到設定閾值時所經過的擴增循環數。相同模板進行 96 次擴增，終點處產物量不恒定，但 Ct 值卻極具重現性。

    模板 DNA 量越多，熒光達到域值的循環數越少，即 Ct 值越小。Log 起始模板濃度與 Ct 呈線性關系，通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，根據樣品 Ct 值，就可以計算出樣品中所含的模板量。

目前常用熒光標記方法

儀器與耗材

    在普通 PCR 儀的基礎上增加一個熒光信號采集系統和計算機分析處理系統，就成了熒光定量 PCR 儀。其 PCR 擴增原理和普通 PCR 儀擴增原理相同，只是 PCR 擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進行標記，使用引物和熒光探針同時與模板特異性結合擴增。擴增的結果通過熒光信號采集系統實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統得出量化的實時結果輸出，把這 PCR 儀叫做實時熒光定量 PCR 儀 (qPCR 儀)。熒光定量 PCR 儀有單通道，雙通道，和多通道。當只用一種熒光探針標記的時候，選用單通道，有多熒光標記的時候用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標記的目的基因表達產物，因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量，需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。該儀器主要用于醫學臨床檢測，生物醫藥研發，食品行業，科研院校等機構。