在構建融含蛋白表達載體時除了要注意插入片段的方向、讀碼框架與載體保持一致外，注意以下問題可能會減少一些不必要的麻煩，當外源片的插入載體起始密碼的后面，另一個基因的前面時，注意檢查插入后基因的兩端是否引入了新的終止密碼，特別是用到Klenow mung bean 核酸酶，T4 Polymerase 補齊，去粘末端等技術調整讀碼框時或不同酶切位點粘端連接時要注意。如XbaI識別序列隱含終止密碼，調整碼框時就要注意，又如BamH I酶切粘端為GATCC ＿補平后如果接到T 后面就有可能形成TGATCC這種隱含終止密碼的情況。（還有外源基因本身不可帶終止密碼）另外要注意啟動子后面避免出現幾個靠近的不同框架的ATG ，以減少對表達的影響。如果插入片段插到載體終止密碼前和另一個基因后面，則只用注意插入片段前方是否有終止密碼即可。